于桂陽

（湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，湖南 永州 425000）

規(guī)模化、集約化養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展離不開抗菌藥物。然而，抗菌藥物在養(yǎng)殖業(yè)的廣泛使用也引起了動物源細(xì)菌耐藥性的日益加重與廣泛傳播。動物源細(xì)菌耐藥性的流行不僅加大畜禽疫病的防控難度，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，而且動物源耐藥菌還可通過食物鏈感染人體或?qū)⒛退幓蜣D(zhuǎn)移至人體致病菌，給食品安全和人體健康帶來潛在危害[1]。因此開展耐藥性監(jiān)測與分析對獸藥殘留監(jiān)控發(fā)揮著積極作用，本試驗重點監(jiān)測豬源大腸桿菌對常用藥物的耐藥情況調(diào)查及分析。

1 材料與方法

1.1 病料

疑似大腸桿菌病的病料采集。病料采集時間為2010年7月，采集規(guī)模化豬場有腹瀉癥狀仔豬肛試標(biāo)本，分離來自湖南省不同縣區(qū)的6個規(guī)?；B(yǎng)豬場共計65個病料標(biāo)本的大腸桿菌致病菌株。

1.2 培養(yǎng)基與試紙

培養(yǎng)基：普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 （均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司）。

藥敏紙片：氟苯尼考、阿莫西林、頭孢噻呋鈉、安普霉素、環(huán)丙沙星、氨芐青霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素和氯霉素 （頭孢噻呋、氟苯尼考、安普霉素的藥敏紙片自制，其他藥品的藥敏紙片均購自杭州微生物試紙有限公司）。微量生化反應(yīng)管 （杭州微生物試紙有限公司）。

1.3 試驗儀器與材料

試驗材料：接種環(huán)、平皿、三角瓶、新華濾紙、游標(biāo)卡尺、試管、打孔器、注射器、消毒棉簽、移液器、移液管等。

試驗儀器：自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）、電子天平 （北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、SWCJ-1F型單人雙面凈化工作臺 （蘇州凈化設(shè)備有限公司）、GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 （上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、DHZ-D恒溫振蕩搖床 （太倉市實驗儀器設(shè)備廠）、LDZX-50FBS立式電熱壓力蒸汽滅菌器 （上海申安醫(yī)療器械廠）、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 分離培養(yǎng)

用醫(yī)用棉簽采集有腹瀉癥狀豬只肛門內(nèi)的糞樣，采集后將其裝入無菌的EP管或青霉素小瓶中[2]。用滅菌的生理鹽水將糞樣稀釋后，吸取0.5mL稀釋液加入到裝有5mL普通肉湯培養(yǎng)基的試管中，將試管置于恒溫振蕩搖床內(nèi)37℃增菌培養(yǎng)12～16小時后，用接種環(huán)將培養(yǎng)物劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)16小時后用鉑金耳挑取帶金屬光澤、中等大小、表面光滑圓潤的暗紅色單個菌落劃線于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16小時后挑取磚紅色、中等大小、表面光滑濕潤、圓形、扁平的菌落劃線于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行保存。對保存在斜面培養(yǎng)基上的細(xì)菌先涂片，再用革蘭氏染液染色后，用100倍的光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鏡檢，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)和染色特點，將革蘭氏染色為陰性、兩端鈍圓、無芽孢、中等大小的桿菌初步判定為大腸桿菌。

1.4.2 生化試驗

取分離培養(yǎng)物進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖的發(fā)酵試驗，同時進(jìn)行吲哚、M-R、VP和硫化氫試驗。糖發(fā)酵試驗在24小時觀察結(jié)果，其他生化試驗在48～72小時內(nèi)觀察結(jié)果。

1.4.3 藥敏試驗

用鉑金耳在斜面上挑取少量大腸桿菌放入裝有10mL MH液體培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶置于搖床內(nèi)37℃培養(yǎng)8～12小時，取出后與BaCl2標(biāo)準(zhǔn)比濁管進(jìn)行對比并進(jìn)行稀釋，使菌液的濃度與比濁管的濃度相當(dāng)，此時菌液的濃度約為108CFU/mL。

將稀釋好的菌液 （108CFU/mL）倒入MH培養(yǎng)基平板內(nèi)，倒入的菌液量以剛好覆蓋整個培養(yǎng)基表面為宜，讓培養(yǎng)基表面菌液均勻分布，倒掉多余的菌液。用滅過菌的鑷子夾取藥敏紙片，均勻地放置在平板培養(yǎng)基上，每個平板上放7片紙片。紙片放好后靜置10分鐘，然后將平板倒置放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)18小時。將培養(yǎng)了18小時的培養(yǎng)基平板取出后置于背景為黑色的物體上，用游標(biāo)卡尺精確測量抑菌圈的直徑，結(jié)果以毫米 （mm）計。判定標(biāo)準(zhǔn)采用美國臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCLLS）標(biāo)準(zhǔn)判定藥物的敏感性，見表1。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

大腸桿菌在普通瓊脂平板上長出灰白色露珠樣光滑、隆起、邊緣整齊的菌落。在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小的紅色菌落。在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，形成帶有金屬光澤的紫黑色小菌落。對65份樣品進(jìn)行分離純化，分離到了58份大腸桿菌菌株，大腸桿菌分離率89.2%，大腸桿菌分離情況見表2。

2.2 顯微鏡檢查

在光學(xué)顯微鏡下對分離菌株進(jìn)行油鏡觀察，桿菌呈短桿狀、成簇分布或散在，革蘭氏染色陰性，符合大腸桿菌的形態(tài)。

2.3 生化試驗結(jié)果

從表3可以看出，58株分離的菌株均可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、不發(fā)酵蔗糖。M-R試驗、吲哚試驗為陽性，VP試驗陰性，不產(chǎn)生H2S，生化反應(yīng)的符合率均在96%以上，其中葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖等四項生化反應(yīng)符合率均達(dá)到100%，乳糖、M-R試驗和VP試驗等生化反應(yīng)符合率98.3%，吲哚試驗和硫化氫試驗的生化反應(yīng)符合率96.6%，符合大腸桿菌的生化特性。因此根據(jù)生化試驗的結(jié)果可鑒定分離菌株為大腸桿菌。結(jié)果見表3。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

從表4可以看出，58株致病性大腸桿菌對13種受試抗菌藥物均有不同程度的耐藥性。對大腸桿菌耐藥率在70%以上的藥物有四環(huán)素、氨芐青霉素、恩諾沙星、阿莫西林、鏈霉素、諾氟沙星和環(huán)丙沙星等七種藥物，它們耐藥率分別為94.8%、91.4%、86.2%、81.0%、79.3%、74.1%和72.4%；耐藥率在30～70%之間的藥物有慶大霉素、氯霉素和頭孢噻呋鈉三種藥物，它們耐藥率分別為63.8%、63.8%和51.7%；耐藥率在30%以下的藥物有氟苯尼考、丁胺卡那霉素和安普霉素三種藥物，它們耐藥率分別為29.3%、25.9%和5.2%。

從圖1可以看出，抗菌藥物中敏感率最高的為安普霉素 （84.4%），其次為丁胺卡那霉素 （60.3%）。這可能與臨床上這兩種抗菌藥物的使用頻率較小有關(guān)。

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3 分析與討論

3.1 豬源大腸桿菌的耐藥情況分析

本試驗應(yīng)用了13種抗菌藥物對湖南地區(qū)分離的58株豬源致病性大腸桿菌進(jìn)行了藥物敏感性試驗，實驗結(jié)果顯示，豬源大腸桿菌分離菌株對目前常用和應(yīng)用時間較長的抗菌藥物，如四環(huán)素、氨芐青霉素、恩諾沙星、阿莫西林、諾氟沙星等產(chǎn)生了非常嚴(yán)重的耐藥性。豬源大腸桿菌分離株對于一些新藥和未大量應(yīng)用于豬場的藥物如安普霉素、丁胺卡那霉素等則比較敏感。因此細(xì)菌耐藥性與用藥情況密切相關(guān)。

3.2 豬源大腸桿菌耐藥特點

大腸桿菌是革蘭氏陰性菌中最易產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌，試驗結(jié)果顯示，13種抗菌藥物對大腸桿菌均有不同程度的耐藥性，除安普霉素耐藥率只有5.2%外，其它12種抗菌藥物耐藥率均超過25%以上，尤其是氟喹諾酮類藥物作為一種較新的抗菌藥物，其耐藥率不斷增加。值得注意的是，通過比較相關(guān)研究數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)近年來豬源大腸桿菌的耐藥菌譜和耐藥率不斷增加。例如，2004年淮安地區(qū)分離的大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率達(dá)30%。2007年分離的大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率已達(dá)到40%左右，其中恩諾沙星的耐藥率40.7%。本試驗分離大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率為77.6%，其中恩諾沙星的耐藥率86.2%，呈現(xiàn)大幅度地上升，本試驗其它類抗菌藥物的耐藥性也出現(xiàn)類似現(xiàn)象[3]。耐藥產(chǎn)生的原因主要是臨床濫用藥，沒有注意用藥的交替性以及飼料添加藥物，從而導(dǎo)致細(xì)菌對抗菌藥物表現(xiàn)不同程度的耐藥性[4]。同時大腸桿菌一旦獲得耐藥性后，對大多數(shù)藥物的耐藥能力可超過常用治療量的數(shù)倍至數(shù)十倍，形成被膜后耐藥能力可超過常用治療量的數(shù)千倍。

目前，大腸桿菌的耐藥性已非常普遍，臨床上分離的致病性大腸桿菌幾乎都有耐藥性，而且不止耐受一種藥物，因此，我們選擇藥物時不能僅靠經(jīng)驗，而要根據(jù)藥敏試驗選擇敏感藥物，或使用經(jīng)過科學(xué)研究的復(fù)合制劑進(jìn)行治療，才能達(dá)到有效治療，減少耐藥菌出現(xiàn)的目的。

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3.3 耐藥性與獸藥殘留

圖1 敏感率高的前5種抗菌藥物

長期使用抗菌素和濫用抗菌素是藥物殘留及細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的源頭。對人類健康構(gòu)成最大威脅來源于長期使用抗菌素或濫用抗菌素引發(fā)的耐藥性細(xì)菌生長和抗藥基因的轉(zhuǎn)移[5]。長期使用抗菌素或濫用抗菌素和耐藥性是一對孿生兄弟，耐藥性不但主要源于治療人類疾病時大量使用抗菌素，還包括動物生產(chǎn)過程中長期使用抗菌素，使耐藥性的危害越來越嚴(yán)重，安全性隱患日趨突出[6]。本調(diào)查以大腸桿菌為指示菌研究了規(guī)?；i場的細(xì)菌耐藥情況，大腸桿菌作為耐藥性的指示菌能夠從一個側(cè)面反應(yīng)細(xì)菌的耐藥性。試驗結(jié)果顯示，豬源致病性大腸桿菌耐藥率增強，耐藥普擴大。隨著抗菌藥大量、廣泛的使用，加快了細(xì)菌耐藥性的發(fā)展，很多細(xì)菌對藥物由敏感逐漸變?yōu)槟退帲蛴傻退侥退庌D(zhuǎn)為高水平耐藥，由單一耐藥發(fā)展到多重耐藥［7］。由于飼料中添加抗菌藥物，一方面增加了動物性食品中的獸藥殘留，促進(jìn)人源性細(xì)菌耐藥性增加的可能，從而導(dǎo)致人類發(fā)生感染后使用抗生素?zé)o效或藥效下降，對人體健康構(gòu)成威脅；另一方面也導(dǎo)致動物源性細(xì)菌耐藥性的增加，由于耐藥菌株不斷出現(xiàn)而導(dǎo)致抗生素治療無效給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，同時病原微生物的耐藥性增強，醫(yī)療效果不佳，在此情況下，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中使用抗菌藥物控制各種感染性疾病，劑量、范圍、種類的不規(guī)范使用，導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生和細(xì)菌耐藥率的增加，隨著耐藥菌株的日益增多，抗菌藥物對細(xì)菌性疫病的防治效果越來越差，藥物用量也越來越大，如此形成惡性循環(huán)，豬病越來越多，藥越用越多，獸藥殘留問題也越來越嚴(yán)重，從而影響畜禽產(chǎn)品質(zhì)量，威脅人類健康。因此，豬場在應(yīng)用抗菌藥物進(jìn)行臨床治療時，不應(yīng)僅憑經(jīng)驗用藥，有條件的豬場最好根據(jù)藥物敏感性試驗的結(jié)果選擇敏感性高的藥物，并充分考慮這些藥物本身特性和藥物之間的復(fù)雜關(guān)系，采取聯(lián)合或交替用藥，并做到用藥適量，提高藥物防治疾病的效果。

[1]邱春媚，何家康，畢玉海.豬源大腸桿菌的耐藥性調(diào)查與對策.豬業(yè)科學(xué)，2008（08）：38-40

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[3]趙坤，王三虎，張婷，趙恒章，等．豫北地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的耐藥性研究.河南科技學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版．2008，36（1）：59-61

[4]田國寶，王紅寧，黃勇，柳蘋，等．規(guī)?；i場大腸桿菌耐藥性和血清型變化趨勢例. 中國獸醫(yī)雜志，2007，43（10）：31-33

[5]張廣群，王春光，張國磊，呂建存，等．55株豬源大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測.中國動物檢疫，2006，23（2）：34-35

[6]楊柳，王思蘆，羅音久，曾中良，等．對規(guī)?；i場大腸桿菌耐藥性的調(diào)查.四川畜牧獸醫(yī)，2006（5）：26-27

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