王 琛,尤 昕,姜春善,柳明洙,崔鮮花,金春花,金春梅

(1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林延吉133000;2.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室)

Nelin基因是在構(gòu)建正常成人的心臟cDNA文庫(kù)及大規(guī)模篩選表達(dá)序列標(biāo)簽的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)的,是一個(gè)肌組織特異表達(dá)的新基因[1,2]。其編碼與大鼠肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的基因Nexilin高度同源[3],其中間近N端(76-242aa之間)有一典型的F-actin結(jié)合結(jié)構(gòu)域,現(xiàn)已證實(shí)與F-actin結(jié)合的特性,為一新的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白[4,5],具有刺激細(xì)胞遷移和黏附的作用[6]。為了進(jìn)一步研究Nelin基因的遺傳特征和與疾病的關(guān)聯(lián),本研究對(duì)延邊地區(qū)健康人群Nelin基因外顯子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究對(duì)象 抽取經(jīng)知情同意的114例體檢的健康者EDTA-K2抗凝全血1 ml,朝鮮族男性27例,朝鮮族女性24例,漢族男性32例,漢族女性31例。

1.1.2 儀器與試劑 AxyPrep全血基因組DNA小劑量試劑盒購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司,PCR擴(kuò)增試劑盒、DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 引物 針對(duì)Nelin基因第7、8、9、11四個(gè)外顯子,應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物(由于該基因第7內(nèi)含子僅有104個(gè)堿基,因此將第7外顯子、第7內(nèi)含子和第8外顯子設(shè)計(jì)成一個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增),由北京奧科公司合成。序列如下:擴(kuò)增第7-8外顯子片段所用引物為上游引物:5'-TGATGGAGGTAAAGTCCCAT-3',下游引物:5'-GTAGATTTACCAT TTGCCGC-3',片段長(zhǎng)度:563 bp。擴(kuò)增第9外顯子片段所用引物為上游引物:5'-CCTGTGTGATA GTGGCTAAT-3',下游引物:5'-GCAAATACCTTCAACCAACT-3',片段長(zhǎng)度:463 bp。擴(kuò)增第11外顯子片段所用引物為上游引物:5'-GATTGCTTAAACACAGGAAT-3',下游引物:5'-TGCTATTT ACT TCCCAGATT-3',片段長(zhǎng)度:454 bp。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取用AxyPrep血基因組DNA小劑量試劑盒提取。

1.2.2 目的片段DNA擴(kuò)增 以提取的基因組DNA為模板,用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件(三個(gè)片段反應(yīng)條件相同):25 μ l體系,96℃預(yù)變性3 min,96℃30 s,55℃45 s,72℃45 s,循環(huán)35次,72℃延伸2 min,4℃2 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的測(cè)序 由上海申速公司進(jìn)行測(cè)序,應(yīng)用DNAman軟件ClustalW2工具進(jìn)行序列分析與Genbank的Nelin基因序列對(duì)比分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 根據(jù)H-W平衡定律計(jì)算SNP位點(diǎn)的基因型頻率,利用χ2檢驗(yàn)比較觀察到的基因型頻率與預(yù)期基因型頻率之間的差異。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS11.5進(jìn)行 χ2檢驗(yàn);設(shè)定顯著性意義水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增結(jié)果 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示第7-8外顯子的擴(kuò)增片段約為563 bp,第9外顯子的擴(kuò)增片段約為463 bp,第11外顯子的擴(kuò)增片段約為454 bp,與預(yù)期分子量相符(圖1)。

2.2 Nelin基因片段測(cè)序結(jié)果 通過對(duì)4個(gè)外顯子的測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn),其中1個(gè)為NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的rs1166698位點(diǎn),1個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn),NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的本研究人群中沒有發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)3個(gè)。

2.3 rs1166698位點(diǎn)結(jié)果分析 rs1166698位點(diǎn)為第8外顯子區(qū)G-A錯(cuò)義突變(圖2),其基因型頻率為GG:31.6%,GA:52.6%,AA:15.8%,等位基因頻率為G:57.9%,A:42.1%。通過對(duì)延邊地區(qū)人群該位點(diǎn)的民族、性別比對(duì)分析,基因型、等位基因頻率在朝漢族、男女的分布無明顯差異(表1)。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 rs1166698 SNP位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果

表1 Nelin基因 SNP位點(diǎn)(rs1166698)民族、性別、基因型和等位基因頻率分布

2.4 新發(fā)現(xiàn)的SNP 新發(fā)現(xiàn)的SNP是第9外顯子區(qū)A/G錯(cuò)義突變1195 A/G,密碼子由AAA突變?yōu)镚AA(圖3),編碼的賴氨酸轉(zhuǎn)換為谷氨酸,野生基因型AA占88.6%(101/114),突變基因型AG為11.4%(13/114),未發(fā)現(xiàn)突變純合子基因型。

3 討論

Nelin為一個(gè)新的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白[3],其基因功能目前還不明確,最近的研究表明,Nelin具有刺激細(xì)胞遷移和黏附的作用[6],在細(xì)胞肥大、心肌缺血預(yù)適應(yīng)模型中表達(dá)量增加[7,8],基因突變與擴(kuò)張性心肌病相關(guān)[9],提示該基因在心臟的多種病理生理過程中起重要作用。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)最新登記的Nelin基因的人類SNP共有279個(gè)(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/SNP),有8個(gè)cSNP,在 8個(gè) cSNP中包括 1個(gè)同義SNP,一個(gè)單堿基插入突變,6個(gè)錯(cuò)義SNP。本研究所針對(duì)的是肌組織特異表達(dá)的Nelin基因,該基因的結(jié)構(gòu)包含數(shù)據(jù)庫(kù)中的NEXN基因的第7-第13外顯子,在第8、9、11外顯子區(qū)有 4個(gè)錯(cuò)義SNP。由于第7內(nèi)含子僅有104堿基,因此本研究將第7與第8外顯子作為一個(gè)片段,加上第9、11外顯子共三個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析研究。

通過對(duì)4個(gè)外顯子SNP位點(diǎn)的序列分析,發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn),其中 1個(gè)為NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的rs1166698位點(diǎn),另一個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的第9外顯子區(qū)A/G錯(cuò)義突變1195 A/G。rs1166698位點(diǎn)為第8外顯子區(qū)G-A錯(cuò)義突變(48364365 G/A),密碼子由GGA突變?yōu)锳GA,編碼的甘氨酸(Gly)轉(zhuǎn)換為精氨酸(Arg),此位點(diǎn)恰好位于基因的一個(gè)核定位信號(hào)區(qū)域。通過對(duì)延邊地區(qū)人群該位點(diǎn)的分析,其基因型頻率為GG:31.6%,GA:52.6%,AA:15.8%,等位基因頻率為G:57.9%,A:42.1%。該位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率與朝漢民族、男女性別的分布無關(guān)聯(lián)。與歐洲人、北京漢族人群、東京的日本人群的對(duì)比分析,結(jié)果顯示,延邊地區(qū)健康人群Nelin基因多態(tài)位點(diǎn)rs1166698(基因型GG/GA/AA,等位基因G/A)的分布與歐洲人有顯著差異。與中國(guó)北京的漢族人群比較有一定的差異,但差異不明顯,與東京日本人比較差異非常小,基因型分布和等位基因頻率非常接近(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/SNP)。

綜上所述,通過研究我們了解了延邊地區(qū)Nelin基因相關(guān)SNP位點(diǎn)遺傳分布特征,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的突變位點(diǎn)。rs1166698位點(diǎn)位于基因的核定位信號(hào)區(qū)域,推測(cè)其對(duì)基因的功能會(huì)產(chǎn)生一定影響,因此,Nelin基因相關(guān)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性分析研究,為接下來研究Nelin基因與疾病的關(guān)系,尋找新的疾病易感遺傳標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。

[1]Zhao Y,Wei YJ,Cao HQ,et al.Molecular cloning of Nelin,a putitive human cytoskeleton regulation gene[J].ACTA Biochimica et Biophysica Sinica,2001,33(1):19.

[2]魏英杰,丁金風(fēng),趙 勇,等.成人動(dòng)脈和心臟cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及新全長(zhǎng)cDNAs的克隆[J].中國(guó)循環(huán)雜志,1999,14(6):369.

[3]Ohtsuka T,Nakanishi H,Ikeda W,et al.Nexilin:a novel actin filamentbinding protein localized at cell-matrix adherens junction[J].J Cell Biol,1998,143(5):1227.

[4]Wang XM,Meng Xianmin,Cao HQ,et al.Characteristics of the binding features of Nelin with F-actin and screening Nelin interactive proteins[J].Chinese Science Bulletin,2004,49(23):2487.

[5]尤 昕,時(shí) 娜,柳明洙,等.人細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白基因Nelin的原核表達(dá)與分離純化[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2006,22(12):1128.

[6]Wang W,Zhang W,Han Y,et al.NELIN,a new F-actin associated protein,stimulates HeLa cell migration and adhesion[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,330(4):1127.

[7]Kaplan-Albuquerque N,Bogaert YE,Van Putten V,et al.Patterns of gene expression differentially regulated by platelet-derived growth factorand hypertrophic stimuli in vascular smooth muscle cells:markers for phenotypic modulation and response to injury[J].J Biol Chem,2005,280(20):19966.

[8]Mathur P,Kaga S,Zhan L,et al.Potential candidates for ischemic preconditioning-associated vascular growth pathways revealed by antibody array[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,288(6):H3006.

[9]Hassel D,Dahme T,Erdmann J,et al.Nexilin mutations destabilize cardiac Z-disks and lead to dilated cardiomyopathy[J].Nature Medicine,2009,15(11):1281.