李秀娟,李 彤,孫中華

(1.吉林省醫(yī)學(xué)期刊社,吉林長(zhǎng)春130061;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

目前很多學(xué)者認(rèn)為乳腺癌早期就是一種全身性疾病,血行轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在疾病的早期階段[1]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌患者外周血中的腫瘤細(xì)胞含量(Peripheral blood cancer cell,PBCC),以了解腫瘤微小轉(zhuǎn)移情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 均為女性。住院患者77例,年齡23-75歲,中位年齡48歲,其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌41例,低分化腺癌9例,單純癌6例,髓樣癌5例,浸潤(rùn)性小葉癌16例;乳腺良性腫瘤18例,年齡20-69歲,中位年齡45歲;健康體檢者 20例,年齡21-65歲,中位年齡39歲。所有患者均經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)證實(shí),并且均未接受任何治療。

1.2 試劑與儀器

CD45-PE購(gòu)于 Immunotech公司,Anti-Cytok-eratin-FITC購(gòu)于 Dako公司。FASCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 方法

采集各組外周血樣本 1 ml,抗凝,加入 30 μ l CD45-PE,震蕩混勻后,室溫放置30 min,加入OptilyseC裂解液2 ml,裂解至透明,300 rpm/min,離心5 min,將分離出的白細(xì)胞懸浮于0.025%Triton X-100溶液5 min,緩沖液洗 1 次 ,懸浮于100 μ l Anti-Cytokeratin-FITC,室溫30 min后加入緩沖液洗滌2次,最后加入0.5 ml的1%多聚甲醛固定,上機(jī)測(cè)定,每例樣本檢測(cè)1×106-3×106個(gè)細(xì)胞,結(jié)果用每1/106個(gè)細(xì)胞中CK+/CD45-細(xì)胞數(shù)來(lái)表示外周血腫瘤細(xì)胞含量,未檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞為陰性。正常對(duì)照組、乳腺良性腫瘤組樣本作對(duì)照,乳腺癌手術(shù)標(biāo)本用機(jī)械法制成單細(xì)胞,稀釋后摻入正常外周血中作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩樣本率的比較用 χ2檢驗(yàn),兩樣本均數(shù)的比較采用 t檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌外周血腫瘤細(xì)胞含量與年齡和腫瘤大小的關(guān)系

正常對(duì)照組和乳腺良性腫瘤組外周血均未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞,在100 μ l健康人外周血中摻入20個(gè)腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照,共檢測(cè)出1.7×105個(gè)細(xì)胞,其中CK+/CD45-的腫瘤細(xì)胞為17個(gè)。各組年齡和腫瘤大小的乳腺癌外周血腫瘤細(xì)胞含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌外周血中腫瘤細(xì)胞含量與年齡、腫瘤大小的關(guān)系

2.2 乳腺癌外周血腫瘤細(xì)胞含量與TNM分期、病理類(lèi)型和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

由于病理類(lèi)型中低分化腺癌、單純癌、髓樣癌例數(shù)較少,未進(jìn)行與病理類(lèi)型的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析,只進(jìn)行了浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和浸潤(rùn)性小葉癌的分析,這也是臨床較常見(jiàn)的病理類(lèi)型。Ⅲ+Ⅳ期腫瘤細(xì)胞含量和陽(yáng)性例數(shù)均高于Ⅰ+Ⅱ期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;N1高于N0,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和浸潤(rùn)型小葉癌之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌外周血中腫瘤細(xì)胞含量與TNM分期和病理類(lèi)型的關(guān)系

3 討論

微轉(zhuǎn)移是指常規(guī)病理學(xué)檢查不能檢測(cè)到的存在于非血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)的微小轉(zhuǎn)移灶。常規(guī)的病理檢查無(wú)法發(fā)現(xiàn)外周血的微轉(zhuǎn)移,尚不能滿足乳腺癌個(gè)體化治療的需要。有報(bào)道[2]采用免疫組化RT-PCR定量PCR等方法檢測(cè)腫瘤患者外周血微轉(zhuǎn)移,存在著易污染、特異性低無(wú)法精確定量等問(wèn)題,限制了其在臨床中的應(yīng)用[3]。流式細(xì)胞術(shù)可以對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行分析和分選,可以快速定量檢測(cè)[4、5]。本研究采用細(xì)胞角蛋白和CD45雙色免疫標(biāo)記技術(shù),多參數(shù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血孤立腫瘤細(xì)胞含量。Ⅲ+Ⅳ期陽(yáng)性率和腫瘤細(xì)胞含量高于Ⅰ+Ⅱ期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),能夠反映腫瘤負(fù)荷。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性率和腫瘤細(xì)胞含量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),值得注意的是34.3%的腋窩淋巴結(jié)陰性患者外周血中仍發(fā)現(xiàn)大量腫瘤細(xì)胞,可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞血行微轉(zhuǎn)移為判斷病情、指導(dǎo)治療、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)提供了更準(zhǔn)確的依據(jù),較腋淋巴結(jié)更能反映腫瘤細(xì)胞的全身播散狀況。據(jù)報(bào)道有近30%腋淋巴結(jié)陰性患者于術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡[6],這是否意味著本研究中腋窩淋巴結(jié)陰性但發(fā)生外周血微轉(zhuǎn)移的這部分患者,會(huì)在幾年后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,仍有待進(jìn)一步隨訪研究。

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