何 琦 金 磊 周岐新 楊俊霞

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室 重慶市生物化學(xué)與生子生物學(xué)重點實驗室,重慶 400016)

黃連素學(xué)名小檗堿,有廣泛的藥理作用,在治療阿爾茨海默病 (AD)、抗腫瘤、降血糖、調(diào)血脂等方面都有顯著的作用。過氧化物酶體增殖物激活受體 (peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)的一種亞型PPARγ,可控制脂肪的儲存和釋放,并維持機體能量平衡,調(diào)節(jié)胰島素以及血糖的穩(wěn)定,促進脂肪細胞基因的表達,在脂肪細胞分化的早期起正向調(diào)節(jié)作用〔1～3〕。胰島素誘導(dǎo)基因 2(insulin induced gene 2,INSIG-2)是近年來發(fā)現(xiàn)的與脂質(zhì)代謝和脂肪細胞分化密切相關(guān)的基因,其編碼的 INSIG-2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白,通過與膽固醇 (TC)調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 (sterol regulatory element-binding protein,SREBP)及 SREBP裂解活化蛋白 (SREBP cleavage activating protein,SCAP)相結(jié)合,從而影響 SREBP活化而阻斷TC和脂肪酸的合成,在維持體內(nèi) TC代謝穩(wěn)定方面具有十分重要的作用〔4,5〕。因此,PPARγ與 INSIG-2均與體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)生和發(fā)展存在著密切的相關(guān)性。本實驗以飲食誘導(dǎo)的兔高脂模型為研究對象,旨在探討小檗堿調(diào)節(jié)血脂的作用,并進一步探討其作用機制是否與 PPARγ、INSIG-2基因表達相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 清潔級雄性新西蘭大耳白兔,40只,體重2.0～2.2 kg,由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(醫(yī)學(xué)動物合格證:SCXK渝 20070003)。小檗堿購于四川鴻鳴植物制品有限公司,純度≥97%,批號 080626;非諾貝特購于河南開封制藥有限公司,純度≥98%,批號 080527;RNA提取試劑 RNAiso Plus與實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司;PCR引物由上海生工設(shè)計并合成。

1.2 動物分組以及模型制作〔6〕40只白兔單籠飼養(yǎng),自由攝食及飲水。以基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 w后,隨機選取 8只為普通飼料組 (ND),以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。其余 32只以高脂飼料喂養(yǎng) (飼料組成:每 10 kg基礎(chǔ)飼料加 150 g TC、500 g豬油、1 kg雞蛋),并隨機分為高脂飼料組 (HFD);高脂飼料+陽性對照藥非諾貝特組 (FD):高脂飼料基礎(chǔ)上按30 mg?kg-1?d-1灌胃給予非諾貝特;高脂飼料 +小檗堿低劑量組 (BLD):高脂飼料基礎(chǔ)上按 28 mg?kg-1?d-1灌胃給予小檗堿;高脂飼料 +小檗堿高劑量組 (BHD):高脂飼料基礎(chǔ)上按 112 mg?kg-1?d-1灌胃給予小檗堿。每周稱體重,實驗期為 16w。

1.3 血脂的測定 分別于實驗前和實驗?zāi)┙?12 h后兔耳緣靜脈采血,離心分離血清,采用全自動生化分析儀檢測血清TC、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.4 實時熒光定量 PCR法檢測脂肪組織 PPARγ和 INSIG-2基因表達 取兔腎周脂肪組織,在液氮下研磨,按RNAiso Plus試劑說明書提取總 RNA,紫外分光光度計定量并計算 A260/A280比值,瓊脂糖凝膠電泳檢測確保 RNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄體系:5×PrimeScriptTMBuffer 2μl,PrimeScriptTMRT Enzyme MixⅠ0.5μl,Oligo dT Primer 0.5μl,Random 6mers 0.5μl,Total RNA 2μl(300ng),RNase Free d H2O補足至 10μl,混勻。反轉(zhuǎn)錄條件:37℃ 15 min,85℃ 5 s終止反應(yīng)。 PPARγ基因上游引物:5′-AGGACATCCAGGACAACC-3′, 下 游 引 物:5′-GTCTCCGTCTTCTTTATCAC-3′;INSIG-2 基因 上 游引 物:5′-TGGACTGTGGTGGACTTT-3′;下 游 引 物:5′-TGTTTCCCATTGTTATGC-3′;內(nèi) 參β-actin基因上游引物:5′-CGAGATCGTGCGGGACAT-3′,下游引物:5′-AGGAAGGAGGGCTGGAACA-3′。 PCR 反 應(yīng) 體 系(25μl):SYBR Rremix Ex TaqTMⅡ 12.5μl,上下游引物(濃度10μmol/L)各 1μl,cDNA 2μl,滅菌蒸餾水 8.5μl,混勻。反應(yīng)條件均為:95℃,預(yù)變性 5 s;95℃ 5s,55℃ 30s,72℃ 30s,循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后自動生成溶解曲線,結(jié)果以 Ct值表示。以公式 F=2-△△Ct來計算各處理組和普食組之間目的基因的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)用 x±s表示,采用 SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 小檗堿對高脂兔血脂的影響 實驗前各組家兔的血脂水平(TC、TG、LDL-C和 HDL-C)相近,無顯著性差異。經(jīng) 16 w營養(yǎng)干預(yù)后,HFD組、FD組、BLD組、BHD組與 ND組相比,TC、TG和 LDL-C濃度均顯著升高(P＜0.05),表明高脂兔模型建立成功。藥物干預(yù)后,與 HFD組比較,BLD組中 TC、TG及LDL-C濃度均顯著降低(P＜0.05),BHD組 TC、TG濃度顯著降低(P＜0.05),而 FD組則只有 TG濃度顯著降低(P＜0.05)。由此可見非諾貝特具有降低血清TG的作用,而小檗堿則對血清 TG、TC和 LDL-C均有降低作用,以低劑量小檗堿作用更突出。見表 1。

2.2 小檗堿對高脂兔脂肪組織 PPARγ、INSIG-2基因表達的影響 結(jié)果顯示 HFD組PPARγ和INSIG-2mRNA表達明顯高于 ND組(P＜0.05);藥物干預(yù)后,BLD、BHD、FD組 PPARγ mRNA表達較HFD組有明顯下降(P＜0.05),其中BLD組作用最強,FD組次之。而 BLD、BHD、FD組 INSIG-2 mRNA表達則較 HFD組明顯升高(P＜0.05),其中 FD組作用最強,BLD組次之。見圖 1。

表1 小檗堿對高脂兔血脂的影響(mmol/L,x±s,n=8)

圖1 小檗堿對兔脂肪組織 PPARγ、INSIG-2基因 m RNA表達的影響

3 討 論

在體和離體研究表明小檗堿具有改善胰島素抵抗、降低血糖、糾正脂質(zhì)代謝紊亂的作用,但無促進胰島素分泌作用,推測小檗堿是通過胰島素外機制降低血糖,加之藥代動力學(xué)顯示小檗堿在脂肪組織中的濃度最高,提示脂肪細胞是小檗堿的主要靶細胞〔7〕?，F(xiàn)代研究認為小檗堿具有良好的降頹、降脂、提高胰島素敏感性及改善胰島素抵抗的作用〔8〕,但尚未能在更深層面上揭示其作用靶點和具體作用機制。PPARγ是調(diào)節(jié)脂肪生成相關(guān)的基域,在脂肪細胞中濃度較高,是誘導(dǎo)脂肪細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn)小檗堿促進 3T3-L1前脂肪細胞的增殖和降低脂肪細胞胞漿中脂肪的堆積;降低脂肪細胞PPARγmRNA的表達和抑制PPARγ蛋白質(zhì)水平。最新發(fā)現(xiàn)小檗堿抑制 3T3-L1脂肪細胞分化是通過 PPAR信號通路實現(xiàn)的〔9〕。INSIG-2是新近發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)控脂肪代謝的分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜蛋白,通過與SCAP/SREBP復(fù)合物結(jié)合,使其滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),阻止 SREB進入高爾基體進行兩次蛋白酶解加工活化,進而阻斷脂肪細胞的脂質(zhì)合成和分化〔10〕。有研究證明INSIG-2過表達能減少Zucker糖尿病肥胖大鼠和禁食再喂正常大鼠的脂肪合成〔11〕。

本實驗結(jié)果顯示,小檗堿可以明顯降低血清 TG、TC以及LDL-C的濃度,其中低劑量組效果更明顯,證明小檗堿具有良好的降血脂作用。通過實時熒光定量 PCR檢測脂肪組織PPARγ基因表達可見,高脂組 PPARγmRNA表達明顯高于普食組,而小檗堿灌胃給藥后,與高脂組相比,可顯著降低 PPARγ mRNA表達,由此推測小檗堿可通過抑制 PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性,進而抑制其下游靶基因中涉及脂肪細胞分化的如脂肪細胞結(jié)合蛋白 2(aP2)、細胞分化抗原(CD36)、乙酰輔酶 A氧化酶(ACO)、脂蛋白脂酶(LPL)等脂肪細胞分化成熟標記物,從而抑制前脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化,減少脂肪細胞分化過程中脂質(zhì)的堆積。對脂肪組織INSIG-2基因表達檢測結(jié)果顯示,高脂組INSIG-2 mRNA表達較普食組明顯上調(diào),在小檗堿干預(yù)后,INSIG-2 mRNA表達較高脂組顯著升高,其中低劑量組上調(diào)作用更為明顯,這可能是由于 INSIG-2基因參與 TC合成的調(diào)節(jié),同時其自身的表達也受細胞內(nèi) TC濃度的影響,當TC升高時促進 INSIG-2基因表達以抑制TC的合成,當膽固醇降低時則反饋性抑制 INSIG-2基因表達。因此,高脂組隨著 TC合成增加而出現(xiàn)代償性 INSIG-2基因過表達,而高劑量小檗堿則可能與肝細胞內(nèi)膽固醇合成減少而反饋性下調(diào),而出現(xiàn)對INSIG-2上調(diào)作用弱于低劑量小檗堿的現(xiàn)象。由此可見,小檗堿可通過促進 INSIG-2表達,而控制脂質(zhì)合成與脂肪細胞分化,防止過多的脂質(zhì)貯藏。綜上所述,本研究證明小檗堿具有明顯的降血脂作用,其作用機制與下調(diào)脂肪組織 PPARγ基因表達、而上調(diào) INSIG-2基因表達有關(guān)。

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