付笑飛 趙 松 劉東雷 王建軍 (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院,湖北 武漢 430022)

在肺缺血再灌注損傷(lung ischemia reperfusion injury,LIRI)的過(guò)程中細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致肺組織損傷的重要原因之一〔1〕。丙泊酚(propofol)是臨床常用的靜脈麻醉藥,已有研究表明其對(duì) LIRI有一定的保護(hù)作用〔2〕,但其機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過(guò)建立大鼠在體 LIRI模型,觀察丙泊酚對(duì) LIRI肺細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的影響,并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠 42只,體重250～300 g(同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供)。主要試劑:鼠抗Bcl-2、Bax抗體(Santa Cruz公司,美國(guó))、原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL)試劑(Roche公司,德國(guó))、二步法免疫組化檢測(cè)試劑(PV-6001)(北京中杉金橋生物科技有限公司)。主要藥物:丙泊酚注射液(Astra Zeneca公司,意大利)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為 3組,每組14只,分別為:假手術(shù)組(S組),除不作缺血處理外,余同其他組;肺缺血再灌注組(IR組),缺血 1 h,再灌 3 h;丙泊酚組(P組),缺血前 30 min靜脈輸注丙泊酚 5 mg/kg?h-1,缺血 1 h,再灌 3 h。IR組和P組每組又分為兩個(gè)亞組,再灌時(shí)間分別為1、3 h,每個(gè)亞組 7只大鼠。

實(shí)驗(yàn)前 4h禁食,腹腔注射4%戊巴比妥 50mg/kg麻醉后,仰臥位固定。行頸部氣管切開(kāi)、插管,并游離右側(cè)頸靜脈和頸動(dòng)脈。接動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣維持呼吸,右側(cè)經(jīng)靜脈插管、固定,接微量注射泵;然后左側(cè)第 5肋間開(kāi)胸,鈍、銳性結(jié)合游離左肺門(mén)。靜息 5 min后,于呼氣末用無(wú)創(chuàng)血管夾阻斷左左主支氣管、左肺動(dòng)脈和左肺靜脈。阻斷 1 h后開(kāi)放,進(jìn)行再灌注1、3 h。于 1、3h實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)結(jié)扎肺門(mén)取出左肺待用。

1.2.2 肺組織Bcl-2、Bax蛋白檢測(cè) 采用二步免疫組織化學(xué)法(PV)法檢測(cè) Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)情況。各組標(biāo)本用 10%甲醛固定,石蠟包埋切片,嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行操作,陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)染色呈棕色,陰性對(duì)照組用 PBS代替一抗。在顯微鏡下觀察,每張切片隨機(jī)選取 5個(gè)視野,使用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)分析陽(yáng)性區(qū)域平均光密度值(OD),以O(shè)D值大小代表陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)的多少。

1.2.3 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè) 用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。光鏡下觀察細(xì)胞核染為棕黃色為凋亡細(xì)胞。每例標(biāo)本的切片隨機(jī)選取 5個(gè)高倍鏡視野(40×10),按凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%計(jì)算。

1.2.4 肺組織病理學(xué)檢測(cè) 4%多聚甲醛固定 24h,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下(×200)進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均采用 SPSS13.0軟件分析,數(shù)據(jù)以x±s表示,組間比較采用 t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 肺組織 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及 Bcl-2/Bax比值變化 與 S組相比,IR組、P組肺組織 Bcl-2、Bax蛋白含量均明顯增加(P＜0.05);與 IR組相比,P組 Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加,Bax表達(dá)減少(P＜0.05),見(jiàn)表 1。

表1 再灌注后不同時(shí)相Bcl-2、Bax蛋白(OD值)及 Bcl-2/Bax比值變化(x±s)

2.2 肺細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)變化 與 S組相比,IR組、P組肺AI值均明顯增加(P＜0.05);與IR組相比,P組各時(shí)相 AI值減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IR組、P組各組內(nèi)各時(shí)相均以再灌注 3h時(shí) AI值最高,見(jiàn)表 2。

表2 再灌注后不同時(shí)相肺細(xì)胞AI值變化(x±s)

2.3 肺組織病理學(xué)檢查 光鏡下觀察 HE染色病理切片,S組肺組織結(jié)構(gòu)完好,肺泡腔完整,無(wú)明顯滲出。水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn);IR組肺泡壁明顯增厚,肺泡腔縮窄,可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);P組肺組織病理改變較IR組輕,表現(xiàn)為肺泡壁輕度水腫及增厚,肺泡內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討 論

LIRI可發(fā)生于多種臨床情況,是肺移植早期和心肺轉(zhuǎn)流術(shù)后肺功能障礙的重要原因之一,而在LIRI發(fā)生過(guò)程中,由于細(xì)胞內(nèi)活性氧增加、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)及持續(xù)的低 pH等多種誘因,導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡從而使肺功能受損。研究表明,Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因中的重要成員,Bcl-2是主要的抑凋亡基因,它主要通過(guò)阻止線粒體內(nèi)細(xì)胞色素 C的釋放、抑制 caspase-3激活來(lái)阻止細(xì)胞凋亡〔3〕;Bax是 Bcl-2的同源體,其作用是通過(guò)抑制 Bcl-2來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔4〕,Bcl-2/Bax的比例關(guān)系與細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)〔5〕。本研究中觀察到 IR組、P組肺細(xì)胞AI值與 S組相比明顯增加(P＜0.05),證實(shí)了細(xì)胞凋亡在LIRI中起到重要作用。與 IR組相比,P組可明顯增強(qiáng)肺組織 Bcl-2蛋白的表達(dá),降低Bax蛋白的表達(dá),使 Bcl-2/Bax比值增加而細(xì)胞凋亡指數(shù)降低,說(shuō)明丙泊酚可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax途徑來(lái)抑制 LIRI。

丙泊酚是一種新型的酚類靜脈麻醉藥,其化學(xué)成分為 2,6-二異丙基酚,大量研究顯示其對(duì)缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用,這種作用可能與其清除自由基的抗氧化作用有關(guān)〔6〕。本研究中病理切片觀察到給予丙泊酚后肺組織水腫及炎性滲出較IR組明顯減輕,說(shuō)明丙泊酚可以通過(guò)減輕肺水腫起到對(duì)肺組織缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,這與徐詠梅等〔2〕的研究結(jié)論相一致。此外丙泊酚還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡起到抗凋亡的作用〔7〕。

1 Cobelens PM,Putte BP,Kavelaars A,et al.Inflammatory consequences of lung ischemia-reperfusion injury and low-pressure ventilation〔J〕.J Surg Res,2009;153(2):295-301.

2 徐詠梅,薄玉龍,呂湘琪,等 .丙泊酚對(duì)大鼠肺缺血-再灌注損傷的影響〔J〕.臨床麻醉學(xué)雜志,2007;23(9):756-8.

3 Park SE,Park C,Kim SH,et al.Korean red ginseng extract induces apoptosis and decreases telomerase activity in human leukemia cells〔J〕.J Ethnopharmacol,2009;121(2):304-12.

4 Garcia EJ,Lawson D,Cotsonis G,et al.Hepatocellular carcinoma and markers of apoptosis(Bcl-2,Bax,Bcl-x):prognostic significance〔J〕.Applied Immunohistochem Mol Morphol,2002;10(3):210-7.

5 Huang YC,Chuang LY,Hung WC.Mechanisms underlying nonsteroidal anti-inflammatory drug-induced p 27(Kip1)expression〔J〕.Mol Pharmacol,2002;62(6):1515-21.

6 Chen L,Gong Q,Xiao C.Effectsof propofol,midazolam and thiopental sodium on outcome and amino acids accumulation in focal cerebral ischemia-reperfusion in rats〔J〕.Chin Med J,2003;116(2):292-6.

7 曹江北,李云峰,米衛(wèi)東,等 .丙泊酚對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)?藥學(xué)分冊(cè),2002;19(5):293-6.