徐曉健,宋長征,呂麗燕

(1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心 國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250062;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院內(nèi)分泌與代謝病研究所,山東濟(jì)南 250062;3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤防治研究所,山東濟(jì)南 250117)

化學(xué)分子伴侶對重組綿羊IFN-tau在大腸埃希菌中可溶性蛋白表達(dá)的影響*

徐曉健1,宋長征2*,呂麗燕3

(1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心 國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250062;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院內(nèi)分泌與代謝病研究所,山東濟(jì)南 250062;3.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤防治研究所,山東濟(jì)南 250117)

為探索化學(xué)分子伴侶對重組綿羊胚胎干擾素(roIFN-tau)在大腸埃希菌中可溶性蛋白表達(dá)的影響,以oIFN-tau cDNA為模板PCR法擴(kuò)增oIFN-tau成熟肽基因后,擴(kuò)增產(chǎn)物和pBV221表達(dá)載體分別用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切、連接,構(gòu)建表達(dá)載體,并進(jìn)行雙酶切和測序鑒定。用不同濃度的化學(xué)分子伴侶(甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、蔗糖、D-甘露醇、二甲基亞楓、乙醇)于42℃誘導(dǎo)陽性重組菌表達(dá) 4 h,分別取E.coli上清和沉淀做SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析結(jié)果表明,甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、蔗糖、二甲基亞砜對oIFN-tau的表達(dá)形式?jīng)]有影響,而D-甘露醇和乙醇增加了oIFN-tau的可溶性表達(dá),為進(jìn)一步的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

化學(xué)分子伴侶;重組oIFN-tau;可溶性表達(dá)

綿羊胚胎干擾素(ovine interferon-tau,oIFN-tau)作為新型的Ⅰ型干擾素,是一種非糖基化蛋白,分子質(zhì)量約為20 ku,等電點(diǎn)為pI 5.2～5.5。成熟的IFN-tau是由172個氨基酸殘基組成的低分子質(zhì)量酸性蛋白質(zhì),相對于 IFN-α和IFN-β(166個氨基酸),在C末端有6個氨基酸殘基的延伸。它具有強(qiáng)的抗黃體溶解、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能[1-2],特別是對逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制的高度特異性以及對自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)活性,除此之外,IFN-tau在生物學(xué)功能方面有自身特點(diǎn),它僅在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá),無需病毒誘導(dǎo)[3],更為突出的是高濃度IFN-tau表現(xiàn)出較其他Ⅰ型干擾素較小的細(xì)胞毒性?；瘜W(xué)分子伴侶是一類能夠在體外穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的小分子化合物,包括有機(jī)溶劑二甲基亞砜、滲透物阿拉伯糖、葡萄糖及氧化三甲胺等,在體外已被廣泛用于阻止蛋白的聚集及包涵體的形成[4]。鑒于oIFN-tau的重要作用,為了深入研究其功能,首次探討了化學(xué)分子伴侶對roIFN-tau在大腸埃希菌中表達(dá)時可溶性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌種 攜帶oIFN-tau cDNA全序列基因片段的 pUC19載體,由日本 Tokyo大學(xué)Imakawa教授惠贈;大腸埃希菌E.coliBL21為美國Novagen公司產(chǎn)品;pBV221表達(dá)質(zhì)粒由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ及附帶10×buffer、TaqDNA 聚合酶、dNTP為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;T4 DNA連接酶、質(zhì)粒DNA快速提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)IFN-tau成熟肽基因序列設(shè)計(jì)合成特異的引物P1和下游引物P2。P1序列:5′GAATTCATATG GGTTGTTACCTGTCTCAGCG3′;P2 5′AAGCTTGGATCC TCAAGGTGAGTTCAGATC3′(加下劃線部分示EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)),引物由上海博亞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 以攜帶oIFN-tau cDNA全基因序列的pUC-19/oIFN-tau質(zhì)粒為模板,以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒載體pBV221分別用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,回收純化后通過T4 DNA連接酶連接。陽性克隆培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒后EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定,并送上海博亞生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pBV221-tau。

1.2.3 可溶性重組oIFN-tau在大腸埃希菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將酶切正確的陽性重組原核表達(dá)質(zhì)粒pBV221的菌種無菌接種于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上,37℃過夜培養(yǎng)。次日,挑取工程菌單菌落接種于含氨芐青霉素的100 mL新鮮 LB培養(yǎng)基中(含100 μ g/mL的氨芐青霉素),37 ℃,200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右,此時加入不同濃度的化學(xué)分子,即4 mL/L～40 mL/L的甘油,10 g/L～100 g/L的葡萄糖,2 g/L～10 g/L的β-環(huán)糊精,0.1 mol/L～0.8 mol/L的蔗糖,5 mL/L～40 mL/L的D-甘露醇,10 mL/L～30 mL/L的二甲基亞楓,10 mL/L～50 mL/L的乙醇,同時迅速升溫至42℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h。

圖1 oIFN-tau成熟肽基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification of oIFN-tau gene

1.2.4 蛋白聚集和可溶性分析 12 000 r/min離心20 min收集菌體后,加入 PBS(含 1 mmol/L PMSF)重懸,置于冰上超聲波破碎菌體(超聲功率為400 W,超聲 10 s,間歇 15 s,20個循環(huán)),12 000 r/min離心 20 min,分離上清和沉淀,進(jìn)行150 g/L SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 oIFN-tau成熟肽基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以P1、P2為引物,以oIFN-tau成熟肽基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增,可以擴(kuò)增出約520 bp左右大小的DNA片段,與預(yù)期的oIFN-tau基因片段長度大小相等(圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒pBV221/oIFN-tau的酶切和測序鑒定

重組質(zhì)粒抽提后經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切出現(xiàn)目的條帶,DNA測序鑒定顯示克隆的 oIFN-tau基因序列與文獻(xiàn)報(bào)道序列相符(圖2)。

圖2 重組表達(dá)載體的BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定 Fig.2 Identification of recombinant ex pression vector by BamHⅠ/EcoRⅠdigestion

2.3 化學(xué)分子伴侶對oIFN-tau表達(dá)狀態(tài)的影響

以不同種類的化學(xué)分子伴侶對重組菌株E.coliBL21/pBV221-tau進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),確定最佳表達(dá)條件為,OD600為0.6時迅速升溫至42℃誘導(dǎo)4 h。經(jīng)150 g/L SDS-PAGE分析顯示,誘導(dǎo)后的重組菌種表達(dá)產(chǎn)物在相對分子質(zhì)量20 ku處出現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)蛋白條帶,與目的蛋白預(yù)期分子質(zhì)量相符。但是不同的化學(xué)分子伴侶對目的蛋白的存在狀態(tài)的影響不同,甘油、葡萄糖、β-環(huán)糊精、蔗糖、二甲基亞楓在所設(shè)定的濃度范圍內(nèi)對目的蛋白的存在狀態(tài)沒有影響,在菌體裂解上清中沒有目的條帶的出現(xiàn)(圖3～圖7)。與上述幾種化學(xué)分子伴侶作用不同,在D-甘露醇和乙醇存在的條件下,菌體裂解上清中分子質(zhì)量為20 ku處有目的條帶的出現(xiàn)(圖8和圖9)。

圖4 葡萄糖對oIFN-tau可溶性表達(dá)的影響Fig.4 T he effect of glucose on soluble ex pression of oIFN-tau

圖5 β-環(huán)糊精對 oIFN-tau可溶性表達(dá)的影響Fig.5 The effect of β-cyclodextrin on soluble expression of oIFN-tau

圖6 蔗糖對oIFN-tau可溶性表達(dá)的影響Fig.6 The effect of sucrose on soluble expression of oIFN-tau

圖7 二甲基亞砜對oIFN-tau可溶性表達(dá)的影響Fig.7 The effect of DMSO on soluble expression of roIFN-tau

圖8 D-甘露醇對oIFN-tau可溶性表達(dá)的影響Fig.8 The effect of D-mannitol on soluble expression of oIFN-tau

圖9 乙醇對oIFN-tau可溶性表達(dá)的影響Fig.9 T he effect of Ethanol on soluble expression of oIFN-tau

3 討論

IFN-tau作為一種新型的Ⅰ型干擾素,除了具有一般Ⅰ型干擾素的共性外,還具有自身的特性,具有抗黃體溶解、非病毒誘導(dǎo)、跨種族活性以及無毒或低毒活性等特點(diǎn)。無毒副作用使其成為比IFNα/β更具有優(yōu)勢的新型分子藥物,為許多疾病的治療帶來了新的希望。目前,在美國重組綿羊IFN-tau治療人多發(fā)性硬化、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及肝炎已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。正是基于這種重要的生物學(xué)功能,IFN-tau純品的獲得成為至關(guān)重要的前提。但是IFN-tau在特定的時間和空間才會表達(dá),并且直接組織培養(yǎng)和提取過程復(fù)雜,通過基因工程技術(shù)表達(dá)重組IFN-tau成為一種有效的途徑。目前外源基因表達(dá)體系主要是大腸埃希菌原核表達(dá)體系和酵母真核表達(dá)體系,本課題組成功地構(gòu)建了IFN-tau的原核表達(dá)體系BL21/pBV221/oIFN-tau,并實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)[5],但是目的蛋白是以無活性的包涵體形式存在,變性復(fù)性過程繁瑣而且收率低。Ottt T L等[6]首先構(gòu)建了IFN-tau的釀酒酵母真核表達(dá)體系,在此體系中實(shí)現(xiàn)了IFN-tau的可溶性表達(dá),而且抗病毒活性達(dá)到0.6×108U/mg與天然IFN-tau活性相當(dāng),但未對表達(dá)量進(jìn)行報(bào)道,為了進(jìn)一步提高IFN-tau的產(chǎn)量,Heeke G V 等[7]和Simha J等[8]采用畢赤酵母作為表達(dá)宿主的發(fā)酵產(chǎn)量分別為280 mg/L和391.7 mg/L。由此可以看出,酵母真核表達(dá)體系盡管能夠得到IFN-tau的活性表達(dá)形式,但是表達(dá)量低且生產(chǎn)過程耗時、成本高。為此,本課題組選用大腸埃希菌原核表達(dá)體系,探索化學(xué)分子伴侶對oIFN-tau可溶性表達(dá)的影響。

化學(xué)分子伴侶是一類能夠在體外穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的小分子化合物,包括有機(jī)溶劑二甲基亞砜、滲透物阿拉伯糖、葡萄糖以及氧化三甲胺等。Sato S等[9]利用甘油和氧化三甲胺均能夠糾正β-F508蛋白的錯誤折疊,產(chǎn)生功能性的表達(dá)產(chǎn)物。β-環(huán)糊精是一種環(huán)狀寡糖,呈筒狀結(jié)構(gòu),其兩端與外部為親水性,內(nèi)部為親脂性中心,已被用來阻止部分折疊蛋白的不可逆性聚集。β-環(huán)糊精通過其疏水性內(nèi)核與未折疊蛋白相互作用掩蓋的蛋白疏水殘基,幫助蛋白重新折疊,從而提高蛋白的可溶性。Karuppiah N等[10]報(bào)道,在碳酸酐酶的復(fù)性過程中β-環(huán)糊精阻止聚集的發(fā)生。最近,Du X B等[11]首次嘗試了細(xì)胞培養(yǎng)過程中β-環(huán)糊精對單鏈Fv抗體可溶性表達(dá)的作用,結(jié)果表明添加β-環(huán)糊精后可溶性單鏈Fv抗體比對照組高出4.17倍。與此同時Dud等還探索了甘油和葡萄糖對單鏈Fv抗體可溶性表達(dá)的作用,結(jié)果顯示甘油對單鏈Fv抗體可溶性部分的含量的提高起到一定作用,而葡萄糖則不明顯。但在本研究中,不同濃度的甘油、β-環(huán)糊精并未增加IFN-tau的可溶性,葡萄糖也未能改變IFN-tau的表達(dá)狀態(tài)但提高了蛋白總量的表達(dá),與Du等的報(bào)道相一致,這可能是由于葡萄糖有更高的碳利用率。

Kagawa N等[12]報(bào)道轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程中滲透壓反應(yīng)對于表達(dá)功能性蛋白具有重要意義,當(dāng)攜帶BL21/pBV221-tau的工程菌添加 5 mL/L～40 mL/L的D-甘露醇后在培養(yǎng)液中產(chǎn)生了一定的滲透壓,可能激活了RNA酶δs亞基(也稱為δ38)調(diào)節(jié)滲透壓反應(yīng)基因的表達(dá),促進(jìn)了oIFN-tau的可溶性表達(dá)。但是0.1 mol/L～0.8 mol/L的蔗糖卻未能改變oIFN-tau表達(dá)狀態(tài),盡管它也能夠在培養(yǎng)液中產(chǎn)生一定的滲透壓。

在大腸埃希菌中,乙醇不僅是一種有效的熱休克反應(yīng)誘導(dǎo)因子,而且能夠激活 RNA酶δ32亞基調(diào)節(jié)應(yīng)激蛋白的表達(dá)包括分子伴侶如Dnak-DnakJGrpE和GroEL-GroES裝置,這些分子伴侶的表達(dá)能夠輔助外源的正確折疊[13]。當(dāng) 10 mL/L～50 mL/L的乙醇添加到培養(yǎng)液中后促進(jìn)了分子伴侶的表達(dá),分子伴侶則輔助oIFN-tau的形成正確構(gòu)象。

本研究探索了化學(xué)分子伴侶對重組 oIFN-tau的可溶性表達(dá)的影響,結(jié)果表明D-甘露醇和乙醇是oIFN-tau的可溶性表達(dá)的有效誘導(dǎo)子,為功能性oIFN-tau的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ),這也是我們首次報(bào)道了D-甘露醇對外源蛋白質(zhì)oIFN-tau可溶性表達(dá)的作用,同時為其他外源蛋白質(zhì)在原核中的可溶性表達(dá)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Effect of Chemical Chaperones on Soluble Expression of Recombinant Ovine Interferon-tau inE.coli

XU Xiao-jian1,SONG Chang-zheng2,L¨U Li-yan3

(1.Key Laboratory f or Biotech-Drug of Health Ministry,Shandong Academy of Medical Sciences,J inan,Shandong,250062,China;2.Shandong Endocrinopathy and Metabolic Disease Institute,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan,Shandong,250062,China;3.Shandong Tumor Hospital and Institute,Shandong Academy of Medical Sciences,J inan,Shandong,250117,China)

To explore the effect of chemical chaperone on the soluble expression of recombinant ovine interferon-tau inE.coli,pUC-19/oIFN-tau cDNA was used as template to amplify oIFN-tau gene by PCR.The products and pBV221 were double digested withEcoRⅠandBamHⅠ,then ligated with T4 DNA ligase to construct the expression vector.The expression vector was identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.Different concentrations of chemical chaperones(glycerol,glucose,β-cyclodextrin,sucrose,D-mannitol,DMSO,ethanol)acted on recombinantE.coliBL21 at 42℃for 4 h,respectively.The supernatant and precipitation of inducedE.coliBL21 cells were then analyzed by SDS-PAGE.The SDSPAGE showed that glycerol,glucose and β-cyclodextrin,sucrose,DMSO had no effect on the expression formation of oIFN-tau.But D-mannitol and ethanol enhanced the soluble expression of oIFN-tau.This forms a basis for further studying the functions of oIFN-tau.

chemical chaperone;recombinant ovine IFN-tau;soluble expression

Q785

A

1007-5038(2010)01-0001-05

2009-07-07

山東省科技廳項(xiàng)目(0310501010)

徐曉健(1982-),男,山東濟(jì)寧人,碩士研究生,主要從事微生物與生化藥學(xué)研究。*通訊作者

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