陳鴻軍,王 偉,劉佩紅,王水明,丁 鏟*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241;2.上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海 200102;3.江蘇省出入境檢驗檢疫局,江蘇南京 211000)

鳥分支桿菌鳥亞種泛酸激酶原核表達及純化*

陳鴻軍1,王 偉1,劉佩紅2,王水明3,丁 鏟1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241;2.上海市動物疫病預(yù)防控制中心,上海 200102;3.江蘇省出入境檢驗檢疫局,江蘇南京 211000)

為了尋找分支桿菌耐藥菌的新藥靶點,根據(jù)GenBank的相應(yīng)序列,利用特異性引物經(jīng)PCR擴增獲得了鳥分支桿菌鳥亞種的泛酸激酶基因,將該基因亞克隆入pET32a(+)載體中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDSPAGE檢測。結(jié)果表明,該基因成功獲得表達,并以可溶性蛋白形式存在,利用His純化試劑盒獲得了純化產(chǎn)物,為下一步進行酶活性測定、酶活性位點的突變及合成酶類似物等研究奠定了基礎(chǔ)。

鳥分支桿菌鳥亞種;泛酸激酶;可溶性表達

結(jié)核病(Tuberculosis)已成為僅次于艾滋病的第二大致死性疾病,而且常與艾滋病共感染,患者體內(nèi)出現(xiàn)播散性鳥分支桿菌(Mycobacterium avium)感染,這些分離株對抗結(jié)核藥物具有廣譜耐受性。這使得結(jié)核病成為人類及動物的重大威脅,而研制新的抗結(jié)核藥物已成為當(dāng)前最重要的課題之一[1-2]。

泛酸激酶(Pantothenate kinase,PanK)在分支桿菌中由coaA編碼。該酶是輔酶A(CoA)合成的關(guān)鍵性限速酶,在能量代謝和細胞壁的生物合成過程中,發(fā)揮至關(guān)重要的作用[2]。泛酸激酶功能保守,但在進化上高度分化。因此,這使得泛酸激酶成為藥物研發(fā)的潛在靶點,如一些泛酸類似物可被泛酸激酶磷酸化,進入CoA的合成途徑,生成無活性的CoA類似物,阻斷下游代謝途徑,從而發(fā)揮療效[4-5]。

鳥分支桿菌病是由鳥胞內(nèi)分支桿菌復(fù)合體(M.aviumcomplex或M.aviumintracellulare complex,MAC)引起的重要人畜共患病[1]。MAC感染后可侵害多種組織器官包括肺、骨髓和淋巴結(jié)等。鑒于鳥分支桿菌的coaA基因編碼相同功能的泛酸激酶,亦可考慮作為抗結(jié)核藥物潛在的靶點。而目前國內(nèi)外有關(guān)鳥分支桿菌coaA基因體外表達及相關(guān)功能的研究報道很少[2-3]。因此,本研究擬對鳥分支桿菌鳥亞種的泛酸激酶進行克隆和表達,旨在為尋找抗鳥分支桿菌新的藥物靶標奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 鳥分支桿菌鳥亞種(M.aviumsubsp.avium)ATCC15769株購自上海市肺科醫(yī)院檢驗科;大腸埃希菌工程菌DH5α、大腸埃希菌表達菌BL21(DE3)購于天根公司;pET-32a(+)載體購自Merck公司。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、pGEM-T easy載體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;His?Bind?kits購自Novagen公司;ECL顯色試劑盒購自Pierce公司;彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker和6×His抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 吸取500 μ L細菌培養(yǎng)物,經(jīng)高壓滅活,12 000 r/min離心5 min,棄上清,沉淀物中加1 mL 50 g/L NaOH 并振蕩混合,室溫靜置10 min,然后以12 000 r/min離心5 min,棄上清,沉淀物用1 mL TE溶液懸浮,離心重新收集菌體;用 400 μ L TE 溶液 懸 浮,加 20 μ L 溶菌酶(50 mg/mL),RNase 10 μ L(10 mg/mL),60 ℃水浴60 min;加入 10 μ L 蛋白酶 K(10 mg/mL)和50 μ L 100 g/L SDS溶液,60℃水浴60 min;冰上冷卻后取出,按常規(guī)酚-氯仿抽提法提取DNA。

1.2.2 擴增結(jié)核桿菌coaA基因序列 根據(jù)Gen-Bank中M.avium coaA基因(登錄號:NC-002944)序 列 設(shè) 計 引 物,上 游 為:5′-CGGGATCCATGTCGCGGCTTAGCGAG-3′, 下 游 為 5′-CGGAATTCTTACAGCT TGCGCA GCCGCAG-3′,兩端帶有BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點,由上海英駿公司合成。反應(yīng)參數(shù)為:95℃熔解1 min,53℃退火30 s,72℃延伸30 s,上述步驟設(shè)定30個循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳切膠回收(具體操作步驟參照DNA凝膠回收試劑盒說明書),得到目的基因。

1.2.3 重組載體的構(gòu)建 將目的基因和 pET-32a(+)載體用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切,37℃孵育3 h,2倍體積無水乙醇置-20℃沉淀20 min以上,12 000 r/min離心 5 min,棄去上清,待乙醇揮發(fā)完全后,沉淀用相應(yīng)體積水溶解。酶切后的目的基因與載體連接,4℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。

1.2.4 重組載體的鑒定 挑選平板上的單菌落,搖菌后用質(zhì)粒小提試劑盒提質(zhì)粒,BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鑒定、PCR及電泳進行初步鑒定,選取目的片段鑒定,正確的一個質(zhì)粒進行序列測定,由上海英駿公司測序。重組質(zhì)粒分別命名為pAcoaA。

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸埃希菌BL21中,轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的鑒定。分別挑取單個重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌的單菌落,按1∶100接種于新鮮的含Amp的2×YT液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至OD600達0.6～0.8;誘導(dǎo)組加入IPTG至濃度為0.2 mmol/L誘導(dǎo)表達4 h,12 000 r/min離心 5 min,去上清,沉淀用 PBS懸浮洗滌3次備用。同時對pET-32a(+)空載體轉(zhuǎn)化菌進行同樣的平行處理作為載體對照。

將上述菌體沉淀用適量的PBS重懸,加等體積的2×SDS上樣緩沖液(0.1 mol/L T ris-Cl pH 6.8,40 g/L SDS,0.2 mol/L二硫蘇糖醇,2 g/L溴酚蘭,200 mL/L甘油),混勻,煮沸 10 min,12 000 r/min離心5 min,各取 10 μ L進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠50 g/L,分離膠 120 g/L),恒壓90 V,150 min?？捡R斯亮蘭R250(含500 mL/L甲醇,100 mL/L乙酸、2 g/L考馬斯亮蘭R250)染色2 h后脫色過夜。

1.2.6 融合蛋白可溶性分析 按1%的接種量接種于新鮮的含Amp的20 mL 2×YT液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至OD600達 0.6～0.8,加入 IPTG 至終濃度為0.2 mmol/L,37℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心,棄去上清,全部菌體離心后的沉淀用5 mL PBS(pH7.2)重懸,超聲波裂解菌體,工作時間2 s,間歇時間2 s,400 W破碎(冰浴)90次離心后將上清轉(zhuǎn)移至另一容器中,沉淀用500 μ L PBS(pH 7.4)重懸,各取20 μ L上清及沉淀懸液加入等體積的2×SDS上樣緩沖液,混勻,煮沸10 min,12 000 r/min離心5 min,各取10 μ L 進行SDS-PAGE 電泳 。

1.2.7 融合蛋白的純化 大量制備可溶性重組蛋白,收集菌體后用試劑盒中的1×binding buffer懸浮,超聲波裂解,12 000 r/min離心5 min,收集上清。參照試劑盒(His?Bind?kits)說明書純化融合蛋白。

1.2.8 Western blot鑒定 將處理過的樣品,10 μ L/孔樣品上樣,做兩面膠,待電泳結(jié)束后,一面膠用于考馬斯亮藍染色,另一面膠用于轉(zhuǎn)印濃縮膠電泳電壓80 V左右,分離膠電泳電壓90 V～120 V,待溴酚藍泳動至距膠下緣1 cm以上結(jié)束電泳。濕轉(zhuǎn)NC膜,按0.625 mA/cm2設(shè)定電流,轉(zhuǎn)印120 min。100 g/L脫脂乳4℃封閉過夜。

在NC膜上加待檢抗體:稀釋液1∶1 000稀釋6×his抗體,以覆蓋膜為適,室溫搖床振蕩孵育1 h～2 h。PBST洗滌 3次;加入 100 g/L脫脂乳1∶10 000稀釋的HRP標記鼠源二抗,以覆蓋膜為適,室溫搖床振蕩孵育1 h～2 h。PBST洗滌3次;ECL顯色按1∶1比例混勻A液、B液,覆蓋在NC膜上顯影。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以提取的基因組為模板,PCR擴增目的基因。PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果表明,所擴增出的基因coaA與預(yù)期的大小(939 bp)相吻合。用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切pAcoaA(鳥型)重組質(zhì)粒,獲得陽性克隆。

2.2 重組蛋白的原核表達

將pAcoaA質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化 BL21(DE3),經(jīng)37℃培養(yǎng)達到生長對數(shù)期,0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h收集菌體,超聲波裂解;SDS-PAGE電泳分析,pAcoaA重組蛋白在沉淀及上清中均存在,部分以可溶性蛋白形式表達,融合蛋白大小約為 47 ku(圖1)。

2.3 重組蛋白的純化

原核表達的重組蛋白鳥分支桿菌coaA經(jīng)His?Bind?Resin kits(Novagen)純化后,SDSPAGE電泳結(jié)果(圖2)顯示,得到純化的蛋白。

圖1 pAcoaA原核表達Fig.1 Prokaryotic expression of AcoaA

圖2 pAc oaA純化蛋白電泳結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE of purified pAcoaA protein

2.4 重組蛋白活性的鑒定

采用 Western blot方法,用 His抗體檢測pAcoaA純化的重組蛋白活性,試驗結(jié)果顯示,純化蛋白具有免疫活性(圖3)。

圖3 Western blot鑒定Fig.3 Western blot analysis

3 討論

Thorel M F等[2]根據(jù)表型和核酸序列分析提出鳥分支桿菌有4個亞種,即鳥分支桿菌鳥亞種(Maa),鳥分支桿菌副結(jié)核亞種(Map),鳥分支桿菌森林亞種(Mas)和鳥分支桿菌土壤亞種(Mah)。導(dǎo)致MAC感染的主要是Maa。目前,用于治療MAC感染的藥物包括注射阿米卡星、口服氯法齊明、異煙肼、乙胺丁醇、利福平、環(huán)丙沙星、利福布丁、克拉霉素和阿奇霉素等。隨著這些藥物的使用,鳥分支桿菌的耐藥性也隨之增強[1]。因此,為了更好地防治該病,新藥靶點的研究迫在眉睫。

coaA基因業(yè)已被證實為結(jié)合分支桿菌生長所必須的基因,它是體內(nèi)CoA生物合成起始的關(guān)鍵酶。不同類型的細菌有特有的泛酸激酶,大致分為3大類型。大腸埃希菌產(chǎn)生類型Ⅰ的泛酸激酶,由coaA基因編碼;金黃色葡萄球菌產(chǎn)生類型Ⅱ,與4種真核亞型 PanK1α、PanK1β、PanK2、PanK3 相似,而且不受反饋抑制的調(diào)控;銅綠假單胞菌產(chǎn)生類型Ⅲ,由coaX編碼,不被CoA及其類似物抑制,廣泛存在于多種細菌中。類型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都包括兩個相同的單體,它們彼此結(jié)合,形成全酶[5-9]。

分支桿菌coaA基因編碼的coaA已被證實為結(jié)核分支桿菌生長所必需的基因,它是體內(nèi)CoA生物合成起始的關(guān)鍵酶[10]。結(jié)核分支桿菌的coaA基因同原核、真核生物(尤其是人類)的同類基因的差異較大,可以做為抗結(jié)核藥物潛在的靶點[1,10]。

理論上,能夠以泛酸激酶為靶點而作為抑制藥物的化合物有2類,即一類是抗代謝藥物,如N5-Pan;另一類是泛酸激酶抑制劑。一些泛酸類似物可以被泛酸激酶磷酸化,以此進入輔酶A的合成途徑,生成沒有活性的輔酶A的類似物,從而阻斷下游代謝途徑。在細菌中,CoA及其硫酯都可反饋抑制PanK的活性。研究其結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),是因為CoA及其衍生物可與ATP競爭性地結(jié)合到PanK的ATP結(jié)合位點上[8]。

目前,鳥分支桿菌的泛酸激酶研究尚未開展,已有的一些報道主要針對的是結(jié)核分支桿菌和其他病原體[2-3,11]。本試驗成功表達了鳥分支桿菌鳥亞種的泛酸激酶,并以可溶性蛋白形式表達,通過試劑盒純化獲得了純化蛋白。這為下一步進行酶活性測定,酶活性位點的突變、合成類似物等研究奠定了基礎(chǔ)。

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Protokaryonic Expression and Purification ofcoaAinM.aviumsubsp.avium

CHEN Hong-jun1,WANG Wei1,LIU Pei-hong2,WANG Shui-ming3,DING Chan1

(1.Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS,Shanghai,200241,China;2.Shanghai Municipal Center f or Disease Control and Prevention,Shanghai,200102,China;3.J ingsu Provin Entry-Ex it Inspection and Quarantine Bureaue,N anjing,J iangsu,211000,China)

Mycobacteriosis avium is an important zoonosis caused byM.aviumcomplex,especially byM.aviumsubsp.avium(Maa).With the development of strains of high drug resistance,research on new targets of drugs should be extremely urgent.Pantothenate kinase(orcoaA)might be a potential target for new drugs.In current study,coaAgene of Maa was amplified and subcloned into pET32a(+)vector.With the transfected BL21(DE3)bacteria induced by IPTG,the gene was successfully expressed.And the product was soluble inE.coli,and purified by His-band Resin kit.The produced peptide will be carried out to research on determination of enzymatic activity and inhibiting analog design.

Mycobacterium aviumsubsp.avium;coaA;soluble expression

Q786;S852.618

A

1007-5038(2010)01-0013-04

2009-08-21

上海市科技興農(nóng)重點項目[滬農(nóng)科攻字(2006)第5-4號]

陳鴻軍(1979-),男,江蘇南京人,副研究員,博士,主要從事動物結(jié)核病檢測研究。*通訊作者

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