王曉杜,陳培君,沈 陽(yáng),馬志永

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

豬流感病毒聚合酶PB1蛋白亞細(xì)胞定位的研究*

王曉杜,陳培君,沈 陽(yáng),馬志永*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

豬流感病毒PB1蛋白在其復(fù)制中起著轉(zhuǎn)錄作用,是病毒復(fù)制所必需的蛋白?？寺×素i流感病毒的PB1基因,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-7.1-PB1,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后,分別用Western blot和IFA檢測(cè)重組蛋白FLAG-PB1蛋白的表達(dá),結(jié)果表明重組蛋白能在真核細(xì)胞中得到表達(dá),其亞細(xì)胞定位為細(xì)胞核表達(dá),與其功能密切相關(guān),為以后流感病毒的相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)。

豬流感病毒;PB1蛋白;亞細(xì)胞定位

流感病毒屬于正黏病毒科負(fù)鏈RNA病毒,自從1918年發(fā)生西班牙大流行以來(lái),在全世界多次出現(xiàn)大流行,2009年發(fā)生在墨西哥的甲型H1N1流感病毒,是含有豬源流感病毒的三元重配病毒,已經(jīng)傳播到世界各地,2009年6月12日世界衛(wèi)生組織把警戒級(jí)別提高至6級(jí),預(yù)示著流感的再次大流行,感染對(duì)象由老人和兒童轉(zhuǎn)向?qū)η鄩涯甑母咧虏⌒?在流行病學(xué)上的變化,進(jìn)一步體現(xiàn)了流感病毒的強(qiáng)變異性。研究流感病毒的復(fù)制機(jī)制,尋找預(yù)防和治療流感的疫苗和藥物,是當(dāng)務(wù)之急。流感病毒的復(fù)制是3個(gè)P蛋白和NP蛋白形成復(fù)制酶復(fù)合物,相互協(xié)同作用發(fā)揮RNA的復(fù)制作用,同時(shí)可以與病毒基因組RNA結(jié)合形成RNP,是病毒復(fù)制和包裝所必需的[1]。單一決定3個(gè)聚合酶基因的毒力是非常困難的,但是不同物種來(lái)源的病毒聚合酶基因,其物種復(fù)制能力有較大差異,這些可能是流感病毒跨物種傳播的機(jī)制之一。

流感病毒的PB1蛋白由病毒基因組片段2編碼,由757個(gè)氨基酸組成,具有聚合酶活力的蛋白。病毒的RNA聚合酶是由PB1、PB2、PA蛋白形成的異源三聚體,所有的3個(gè)亞基都是病毒復(fù)制所必需的[2]。其中PB2亞基能綁定真核細(xì)胞的mRNA帽子結(jié)構(gòu),并剪切下帽子連作為病毒轉(zhuǎn)錄所需的引物[3]。PB1蛋白主要執(zhí)行是聚合酶的功能,合成病毒所需的3種 RNA,即(v)RNA、(c)RNA、mRNA[4]。該蛋白帶有兩個(gè)必需的核定位序列,推測(cè)可能定位在核內(nèi),發(fā)揮其功能[5]。既然PB1蛋白具有復(fù)制酶的功能,那么其在抗病毒藥物靶標(biāo)分子的研究中具有重要作用,同時(shí)也應(yīng)該在跨種間傳播中發(fā)揮重要功能。本研究克隆豬的H3N2亞型流感病毒PB1基因全長(zhǎng)CDS區(qū),真核表達(dá)PB1蛋白,間接免疫熒光觀察PB1蛋白的亞細(xì)胞定位,為利用PB1蛋白作為抗病毒藥物靶標(biāo)分子的研究,以及研究流感病毒入侵宿主后的機(jī)制等相關(guān)工作做了前期研究。

1 材料與方法

1.1 材料

豬流感病毒(Influenza A/Swine/Jiangsu/2/2006/H3N2)、大腸埃希菌 DH5α、Vero 細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、真核表達(dá)質(zhì)粒p3xFLAG-7.1由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存和提供。AMV反轉(zhuǎn)錄酶、PCR擴(kuò)增用Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、T載體試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。質(zhì)粒抽提和DNA片段回收試劑盒購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)公司。DMEM和胎牛血清購(gòu)于Gibco公司。lipofectamine-2000購(gòu)于invitrogen公司。羊抗小鼠FLAG抗體購(gòu)于Sigma公司。H RP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗和FITC標(biāo)記羊抗小鼠熒光二抗購(gòu)自Santa Cruz公司。ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于Pierce公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆與真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 流感病毒感染MDCK細(xì)胞12 h后,提取細(xì)胞總RNA,利用Hoffman通用引物[6]作為反轉(zhuǎn)錄引物,AMV酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PB1的CDS區(qū)引物:PB1-F:5′TATGTCGACATGGATGTCAATCCG3′;PB1-R:5′CAGGGATCCCTATT T TTGCCGTCT3′。RT-PCR擴(kuò)增出大約2 300 bp的條帶,利用SalⅠ和BamHⅠ雙酶切亞克隆到p3xFLAG-CMV-7.1真核表達(dá)載體上,PCR和酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆。

1.2.2 Western blot檢測(cè)PB1的真核表達(dá) 構(gòu)建好的重組質(zhì)粒p3xFLAG-CMV-7.1-PB1經(jīng)大提試劑盒純化后,測(cè)定質(zhì)粒濃度。根據(jù) lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書的操作步驟,轉(zhuǎn)染2 μ g質(zhì)粒進(jìn)3×105個(gè)細(xì)胞中,同時(shí)轉(zhuǎn)染 p3xFLAG-CMV-7.1空載體和p3xFLAG-CMV-7.1-M1質(zhì)粒作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后,收集細(xì)胞樣品,細(xì)胞裂解總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后,一抗用小鼠抗FLAG抗體,二抗采用羊抗小鼠H RP,利用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。

1.2.3 間接免疫熒光進(jìn)行PB1蛋白的亞細(xì)胞定位Vero細(xì)胞在飛片上長(zhǎng)成單層,然后轉(zhuǎn)染p3xFLAG-CMV-7.1-PB1真核表達(dá)質(zhì)粒(操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行),經(jīng)甲醛和甲醇(1∶1)固定,一抗用小鼠抗FLAG抗體,二抗用羊抗小鼠FITC標(biāo)記的熒光抗體,正置熒光顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

RT-PCR擴(kuò)增出 PB1基因全長(zhǎng) CDS區(qū),大約2 300 bp,亞克隆至真核表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-7.1中,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α,挑克隆后小提質(zhì)粒,用SalⅠ和BamHⅠ雙酶酶切鑒定(圖1)。同時(shí)測(cè)序,鑒定結(jié)果與NCBI上公布的SIV序列99%同源性。

圖1 p3xFLAG-CM V-7.1-PB1酶切鑒定Fig.1 Identification of p3x FLAG-CMV-7.1-PB1 plasmid by restriction enzyme digestion

2.2 Western blot檢測(cè)PB1的真核表達(dá)

重組載體p3xFLAG-CMV-7.1-PB1轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,收取細(xì)胞總蛋白樣品,以FLAG抗體做一抗Western blot檢測(cè)PB1的表達(dá)(圖2),以p3xFLAGCMV-7.1-M1作為對(duì)照,actin抗體顯色作為上樣量的參照,結(jié)果顯示在90 ku大小左右有一條特異帶,證明該蛋白在真核細(xì)胞中得到表達(dá)。

圖2 Western blot檢測(cè)重組蛋白FLAG-PB1的表達(dá)Fig.2 The expression detection of recombinant protein FLAG-PB1 by Western blot

2.3 PB1蛋白的亞細(xì)胞定位

真核表達(dá)質(zhì)粒 p3xFLAG-CMV-7.1-PB1轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,甲醛固定后,一抗用小鼠抗FLAG抗體,做好飛片后,在熒光顯微鏡下拍照(圖3),結(jié)果顯示綠色代表重組蛋白FLAG-PB1,其表達(dá)主要在細(xì)胞核內(nèi),藍(lán)色顯示的是細(xì)胞核。

3 討論

圖3 重組蛋白FLAG-PB1的亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of recombinant FLAG-PB1 protein

本研究利用帶FLAG標(biāo)簽的真核表達(dá)載體在真核細(xì)胞Vero中表達(dá),Western blot結(jié)果表明建立PB1蛋白真核表達(dá)系統(tǒng),間接免疫熒光結(jié)果表明PB1蛋白在真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),與以前研究人流感病毒該蛋白結(jié)果一致,是與其發(fā)揮復(fù)制酶功能密切相關(guān),為下一步流感復(fù)制機(jī)理的研究做了前期工作。1956年和1968年流感病毒就是因?yàn)榍萘鞲胁《綪B1片段的替換引起病毒復(fù)制效率大大提高,造成毒力上升,致病性增加[7]。高致病性禽流感病毒H5N1其PB1蛋白與病毒復(fù)制效率密切相關(guān),是一個(gè)重要的毒力因子[8]。近來(lái)在流感病毒單個(gè)基因替換的研究中發(fā)現(xiàn)PB1蛋白與病毒毒力密切相關(guān)[9],為研究流感病毒的毒力因子打開(kāi)了另一扇大門,也為防控流感病毒探索了新的研究方向。流感病毒復(fù)合酶是一個(gè)異源多聚體組成,其中PB1、PB2、PA按照1∶1∶1組成發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用。PB1蛋白具有RNA依賴RNA聚會(huì)酶的結(jié)構(gòu)模式,已經(jīng)驗(yàn)證其幾個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域,其N端80個(gè)氨基酸是與PA亞基密切相互作用的結(jié)構(gòu)域,C端則負(fù)責(zé)與PB2結(jié)合,其中506位點(diǎn)和659位點(diǎn)對(duì)這種結(jié)合也是非常關(guān)鍵位點(diǎn)[10]。其綁定病毒vRNA的區(qū)域也在近期得到了驗(yàn)證[11],這些研究為揭開(kāi)流感病毒復(fù)制機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

[1]殷 震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1985:707-728.

[2]Perales B,O rt í n J.The influenza A virus PB2 polymerase subunit is required for the replication of viral RNA[J].J Virol,1997,71:1381-1385.

[3]Shi L,Galarza J M,Summers D F.Recombinant-baculovirusexpressed PB2 subunit of the influenza A virus RNA polymerase binds cap groups as an isolated subunit[J].Virus Res,1996,42:1-9.

[4]Poch O,Sauvaget I,Delarue M,et al.Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements[J].EM BO J,1990(8):3867-3874.

[5]Nath S T,Nayak D P.Function of two discrete regions is required for nuclear localization of polymerase basic protein 1 of A/WSN/33 influenza virus(H1N1)[J].Mol Cell Biol,1990,10:4139-4145.

[6]Hoffmann E,Stech J,Guan Y,et al.Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J].Arch Virol,2001,146:2275-2289.

[7]Kawaoka Y,Krauss S,Webster R G.Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics[J].J Virol,1989,63:4603-4608.

[8]Salomon R,Franks J,Hoffmann E,et al.T he polymerase complex genes contribute to the high virulence of the human H5N1 influenza virus isolate A/Vietnam/1203/04[J].J Exp Med,2006,203:689-697.

[9]Claudia P,Patricia V A,Christopher F B,et al.Single gene reassortants identify a critical role fo r PB1,HA,and NA in the high virulence of the 1918 pandemic influenza virus[J].PNAS,2008,105(8):3064-3069.

[10]Gonzlez S,Zü rcher T,O rt í n J.Identification of two separate domains in the influenza virus PB1 protein responsible for interaction with the PB2 and PA subunits:a model for the viral RNA polymerase structure[J].Nucleic Acids Res,1996,24:4456-4463.

[11]Gonzá lez S,Ortín J.Characterization of influenza virus PB1 protein binding to viral RNA:T wo separate regions of the protein contribute to the interaction domain[J].J Virol,1999,73(1):631-637.

Subcellular Localization of Swine Influenza Virus PB1 Protein

WANG Xiao-du,CHEN Pei-jun,SHEN Yang,MA Zhi-yong

(Shanghai Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Shanghai,200241,China)

PB1 protein of influenza virus plays an important role in virus replication.In this paper,the swine influenza virus PB1 gene was cloned into eukaryotic expression plasmid p3xFLAG-CMV-7.1,the recombination expression plasmid p3xFLAG-CMV-7.1-PB1 was transfected into Vero cells by liposome,the expression of FLAG-PB1 was detected by Western blot and IFA.The result showed that the protein was expressed in eukaryotic cell and its subcellular locus is in nucleus,which is association with its function.The result provides a basis for influenza virus research.

Swine influenza virus;PB1 protein;subcellular localization

S852.659.5;S858.28

A

1007-5038(2010)01-0021-03

2009-07-09

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2007JB02);上海市浦江人才計(jì)劃項(xiàng)目(07pj14109)

王曉杜(1973-),男,湖北紅安人,博士研究生,主要從事病毒與細(xì)胞相互關(guān)系研究。*通訊作者