趙金香,陶大勇,楊麗敏

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾843300)

奶牛的生產(chǎn)水平和養(yǎng)殖效益與繁殖性能密切相關(guān),隨著現(xiàn)代育種水平的提高,日糧營養(yǎng)已成為提高奶牛繁殖率的關(guān)鍵因素[1]。硒和維生素E是提高奶牛繁殖率和生產(chǎn)力的重要物質(zhì),硒是谷光甘肽過氧化物酶的組成成分,可消除脂質(zhì)過氧化物的毒性作用,從而提高免疫機(jī)能[2]。當(dāng)硒和維生素E缺乏時(shí),母牛出現(xiàn)不規(guī)則發(fā)情或根本不發(fā)情,子宮內(nèi)膜炎及卵巢囊腫等疾病發(fā)病率升高,受胎率低,流產(chǎn)或死胎,所產(chǎn)犢牛體質(zhì)差等。實(shí)踐證明,冬春季節(jié)長(zhǎng)期缺乏青綠飼料時(shí),給母牛注射亞硒酸鈉,對(duì)提高母牛繁殖率有良好的作用。若將硒和維生素E加入飼料中飼喂,也能收到很好的效果(100 kg飼料加入0.022 g無水亞硒酸鈉,同時(shí)按每千克飼料加入20～25 IU維生素E)。奶牛配種輸精前后注射亞硒酸鈉和維生素E能明顯提高受胎率[3]。

本試驗(yàn)對(duì)青年荷斯坦奶牛補(bǔ)飼維生素E和硒,觀察奶牛體內(nèi)相關(guān)激素水平的變化及對(duì)發(fā)情率、發(fā)情期受胎率的影響,進(jìn)一步揭示維生素E和硒對(duì)奶牛繁殖性能的影響,為生產(chǎn)實(shí)踐提供一定參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇某奶牛場(chǎng)臨床健康,體重相近,18月齡性成熟的青年荷斯坦奶牛50頭。

1.2 藥物與試劑 維生素E膠丸(上海慶安藥業(yè)集團(tuán)宿州制藥有限公司,產(chǎn)品批號(hào):080106,有效日期至2009年12月),亞硒酸鈉維生素E注射液(重慶希望動(dòng)物藥業(yè)有限公司,產(chǎn)品批號(hào)230171115,有效期至2009年8月)。乙醚、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、0.10 g/L 17α-雌二醇 、對(duì)硝基苯甲酰氯乙腈溶液及雙酚 A、4-壬基酚、17α-乙烴基雌二醇、雌三醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇等標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 儀器設(shè)備 高效液相色譜儀(Waters A lliance HPLC 2695)、SinoChrom ODS_BP(4.6 mm ×150 mm,5 μ m)色譜柱、循環(huán)水式多用真空泵等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 分組 將供試奶牛隨機(jī)分為3組,即對(duì)照組(10頭)、試驗(yàn) A組(20頭)、試驗(yàn)B組(20頭)。對(duì)照組不補(bǔ)飼藥物,試驗(yàn)A組補(bǔ)飼維生素E,試驗(yàn)B組補(bǔ)飼亞硒酸鈉維生素E,見表1。

表1 供試奶牛分組及補(bǔ)飼情況

2.2 血液的采集和處理 頸靜脈采血。對(duì)照組采血1次,試驗(yàn)A組和試驗(yàn)B組每隔5 d采血1次。分離血清,放入冰箱,備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取雙酚A、4-壬基酚、17α-乙烴基雌二醇、雌三醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇(均為Sigma產(chǎn)品)各1.00 mg,于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度線作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,臨用前用甲醇稀釋成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

2.4 色譜條件 色譜柱:SinoChrom ODS-BP(4.6 mm ×150 mm,5 μ m);流速 :1.0 mL/min;柱溫 :25℃激發(fā)波長(zhǎng)為228 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為316 nm;進(jìn)樣量:10 μ L;流動(dòng)相:乙腈-水 ;系統(tǒng)梯度洗脫:0～ 12 min乙腈由 30%(V/V)增加至70%,在 12～12.3 min,乙腈由70%快速增加至100%,并保持至 20 min;反應(yīng)衍生化時(shí)間為30 min。

2.5 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取 0.0、10.0、20.0、40.0 μ L和100.0 μ L混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液,循環(huán)水式多用真空泵揮干。各加入0.10 mL對(duì)硝基苯甲酰氯乙腈溶液,搖勻后處于暗處放置30 min,再加入0.40 mL 30%乙腈-水,離心后,取上清液進(jìn)樣。

2.6 樣品處理 吸取待測(cè)血清0.50 mL于10 mL具塞管中,加入2.0 mL乙腈沉淀蛋白后,再加入1.0 mL 1 mol/L HCl,1.00 mL甲醇和2.0 mL蒸餾水,用8.0 mL乙醚分3次液液萃取,合并提取液,用循環(huán)水式多用真空泵揮干,進(jìn)行衍生,衍生后的樣品按標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。

2.7 奶牛的發(fā)情及受胎觀察 自補(bǔ)飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E后,以20 d為一個(gè)觀察期,供試奶牛的發(fā)情情況主要以外觀臨床表現(xiàn)為主。是否受胎,以人工授精后2個(gè)月直腸檢查為準(zhǔn)。

發(fā)情表現(xiàn):陰門紅腫,黏液增多,掉線,有爬跨行為。直檢卵巢有發(fā)育較好的卵泡。

3 結(jié)果與分析

3.1 流動(dòng)相組成的選擇 見表2。

表2 流動(dòng)相組成的選擇

經(jīng)過多次試驗(yàn),最終選擇0～12 min乙腈由30%(V/V)增加至70%,在 12～12.3 min,乙腈由70%快速增加至100%,并保持至20 min。通過梯度洗脫,可以在20 min內(nèi)同時(shí)基線分離6種衍生物。柱溫25℃和流速1.0 mL/min[2]。

3.2 液相色譜圖 見圖1。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 見表3。以峰面積為縱坐標(biāo),以激素含量為橫坐標(biāo),通過測(cè)定計(jì)算出17β-雌二醇 、雌三醇、4-壬基酚 、17α-乙炔基雌二醇、雙酚 A 、17α-雌二醇在線性范圍內(nèi),R依次為 0.9988,0.9969,0.9971,0.9972,0.9934,0.9958。

3.4 衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性試驗(yàn) 將衍生后的溶液分別放置0 h 、1 h 、2 h、4 h 、1 d及 2 d 后測(cè)定,結(jié)果顯示,在24 h內(nèi),衍生產(chǎn)物峰面積無顯著變化。

3.5 血液中各種雌激素含量的變化 見表4。

由表4可以看出,通過補(bǔ)飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E后,隨著補(bǔ)飼時(shí)間的延長(zhǎng),血液中激素含量持續(xù)增加,試驗(yàn)A、B兩組能測(cè)出的雌激素的種類增多;如第1次補(bǔ)飼后,試驗(yàn)組能測(cè)出3種激素,第3次補(bǔ)飼后能測(cè)出4種激素,第4次補(bǔ)飼后能測(cè)出4～5種激素,而對(duì)照組只能測(cè)出6種激素中17β-雌二醇和雙酚A兩種,且含量均低于試驗(yàn)組。經(jīng)過4次補(bǔ)飼后,17α-乙烴基雌二醇含量仍然較低,未在血液樣品中檢出,如果繼續(xù)補(bǔ)飼,預(yù)計(jì)可檢出。

從試驗(yàn)組來看,試驗(yàn)B組中各激素的含量均比試驗(yàn)A組中的含量高。補(bǔ)亞硒酸鈉維生素E后對(duì)各雌激素含量的影響較大(尤其是對(duì)17β-雌二醇的影響),補(bǔ)飼效果較好。

從試驗(yàn)B組的檢測(cè)結(jié)果來看,長(zhǎng)時(shí)間補(bǔ)飼亞硒酸鈉維生素E后,血液中雌三醇的含量緩慢升高,至第4次補(bǔ)飼后才得以檢測(cè)出,而此時(shí)奶牛血液中的雌二醇含量已比較高;第2次補(bǔ)飼后,雌激素含量升高明顯。根據(jù)結(jié)果分析和從生產(chǎn)實(shí)際考慮,補(bǔ)飼3次即可,以2次較為適宜。

表3 6種激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.6 補(bǔ)飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E后供試奶牛的發(fā)情情況 見表5。

由表5可以看出,對(duì)照組10頭奶牛均未發(fā)情;試驗(yàn)A組只有1頭奶牛發(fā)情,但受胎失敗;試驗(yàn)B組有4頭發(fā)情,其發(fā)情率為20%,4頭發(fā)情奶牛配種之后,受胎3頭,受胎率為75%。說明補(bǔ)飼維生素E膠丸后有利于促進(jìn)奶牛發(fā)情率的升高;維生素E和硒聯(lián)合使用可明顯提高奶牛的發(fā)情率和受胎率,對(duì)提高母牛發(fā)情、情期受胎率有良好的作用。

表4 補(bǔ)飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E之后血液中各種雌激素含量的變化

表5 補(bǔ)飼維生素E、亞硒酸鈉維生素E后供試奶牛的發(fā)情情況

4 討論

4.1 液相條件的選擇 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇、衍生化反應(yīng)條件的選擇、衍生化反應(yīng)時(shí)間的選擇、衍生化反應(yīng)溫度的選擇參照文獻(xiàn)[2]操作。選擇的激發(fā)波長(zhǎng)為228 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為316 nm。采用對(duì)硝基苯甲酰氯為熒光衍生劑,與6種雌激素在無水環(huán)境中發(fā)生熒光衍生化反應(yīng),生成具有強(qiáng)熒光物質(zhì)。選擇反應(yīng)衍生化時(shí)間為30 min,溫度為室溫(25℃)。

4.2 17α-雌二醇和17β-雌二醇是兩種同分異構(gòu)體,在動(dòng)物體內(nèi)主要以 17β-雌二醇的形式存在,17α-雌二醇的活性作用比17β-雌二醇弱;4-壬基酚對(duì)兩種雌激素有抑制作用;雙酚A對(duì)生殖有抑制作用,主要抑制雌二醇,也可使機(jī)體免疫能力下降,具有激素樣效應(yīng)[4-5]。試驗(yàn)結(jié)果顯示,17α-雌二醇和 17β-雌二醇這兩種雌激素和雙酚A的含量在補(bǔ)飼后成百倍地增加,4-壬基酚也有所增加,與試驗(yàn)前和第1次補(bǔ)飼后測(cè)得結(jié)果相比,結(jié)合奶牛的發(fā)情及受胎情況,說明補(bǔ)飼效果較好。

4.3 雌三醇是雌二醇的代謝產(chǎn)物,從試驗(yàn)B組的檢測(cè)結(jié)果來看,長(zhǎng)時(shí)間補(bǔ)飼亞硒酸鈉維生素E后,血液中雌三醇的含量緩慢升高,至第4次補(bǔ)飼后才得以檢測(cè)出,說明奶牛血液中的雌二醇含量已比較高,預(yù)計(jì)再補(bǔ)飼也沒有更大的臨床意義。

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