李 芳，李 燕，龔明玉

（1.承德醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系2006級(jí)，河北承德 067000；2.指導(dǎo)教師）

冠心病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因[1]。在急性心肌梗死后,采用溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)以早期恢復(fù)心肌再灌注是縮小梗死范圍和改善臨床轉(zhuǎn)歸的最有效方法。但動(dòng)物模型研究提示,致死性再灌注損傷最多可占心肌梗死最終體積的50%[2]。研究發(fā)現(xiàn),燈盞花素具有擴(kuò)張血管、降低血液黏滯度、改善微循環(huán)、防治血栓形成的作用,可有效地預(yù)防氯化鋇、腎上腺素過(guò)量所導(dǎo)致的心律失常[3]。本研究通過(guò)用大鼠在體心臟模擬臨床缺血再灌注損傷病理變化,旨在觀察燈盞花素是否具有抗細(xì)胞凋亡等保護(hù)心肌的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）試劑：燈盞花素注射液（吉林龍?zhí)┲扑幑煞萦邢薰荆?，TUNEL檢測(cè)試劑盒（Roche公司）。（2）動(dòng)物：健康SD大鼠40只，體重220±20g，雌雄各半（購(gòu)自天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)scxk津2009-001）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理：40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、缺血再灌注組、燈盞花素I組和燈盞花素II組，每組10只。4組大鼠均制備心肌缺血再灌注模型，其中燈盞花素2個(gè)組大鼠于手術(shù)前1周分別腹腔注射不同劑量的燈盞花素（25mg.kg-1.d-1、50mg.kg-1.d-1），連用7d；正常對(duì)照組和缺血再灌注組術(shù)前分別給予相應(yīng)容積的生理鹽水，時(shí)間同燈盞花素組。

1.2.2 心肌缺血再灌注模型的制備:10%烏拉坦腹腔注射麻醉（1ml.100g-1）大鼠，仰臥位固定，用針型電極插入大鼠四肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。于胸骨左緣3-4肋間切開(kāi)胸壁，暴露心臟，在左心耳與肺動(dòng)脈干之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，同時(shí)在結(jié)扎線與血管之間穿一直徑2mm，長(zhǎng)5mm的硅膠管，結(jié)扎30min；然后剪斷縫合線，取出硅膠管，再灌注2h。假手術(shù)組僅分離前降支，但不結(jié)扎。

1.2.3 心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL染色:(1)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，新配置的3%H2O2溶液室溫放置10min,以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶（POD）,蛋白酶K(25μg/ml)37℃消化30min，加TUNEL混合液，濕盒37℃，60min，加ulcon-POD，37℃，30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。標(biāo)記前用DNA酶處理切片做陽(yáng)性對(duì)照，用標(biāo)記液代替TUNEL反應(yīng)液做陰性對(duì)照。(2)檢測(cè)內(nèi)容：陽(yáng)性細(xì)胞核和（或）細(xì)胞碎片呈深淺不一的棕黃色，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野（×400倍），記數(shù)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，以凋亡指數(shù)（apoptosisindex,AI）做為凋亡程度的指標(biāo)。AI=(視野內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野內(nèi)所有細(xì)胞個(gè)數(shù))×100%

2 結(jié)果

燈盞花素對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響:TUNEL染色陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀。IR組的AI顯著大于control組（P＜0.01）；breI、II組的AI小于IR組（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明燈盞花素可以抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡見(jiàn)附表與圖1-4。

附表 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（n=10，±S）

附表 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（n=10，±S）

與假手術(shù)組比較*P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 給藥劑量（mg .kg-1.d-1）AI正常對(duì)照組 - 4.24±0.96缺血再灌注組 - 15.78±2.09*燈盞花素I組 25 13.97±1.98▲燈盞花素II組 50 10.55±1.27▲▲

3 討論

近些年來(lái),減輕心肌缺血再灌注損傷一直是心臟病學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血再灌注過(guò)程可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡是MIRI的特征之一,并且與心肌遲發(fā)性死亡關(guān)系密切,細(xì)胞凋亡的多少?zèng)Q定著IR損傷的輕重[4、5]。馮全洲等[6]在大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血后可引起細(xì)胞凋亡；趙明中等[7]在大鼠心肌缺血/再灌注時(shí)發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控有序的細(xì)胞非炎癥性死亡,藥物預(yù)處理干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是預(yù)防和治療再灌注損傷的一條新途徑[8]。燈盞花素是從中藥燈盞花中分離得到的黃酮類化合物,現(xiàn)代藥理研究表明燈盞花素具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗凋亡等作用[9]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，缺血再灌注組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加（P＜0.01）,燈盞花素組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較缺血再灌注組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示燈盞花素可以抑制再灌注心肌細(xì)胞的凋亡而具有心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Caspase-3蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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