韓琳娜，周鳳琴

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250355）

大豆(Glycine max（Linn.）Merr.)是我國(guó)主要的油料作物之一，已有五千年栽培歷史，通常被認(rèn)為是由野生大豆（Glycine soja Sieb.et Zucc.）馴化而來(lái)［1］。野生大豆具有耐鹽堿、抗寒、抗病等許多優(yōu)良性狀［2，3］，是重要的野生資源植物，蘊(yùn)藏著豐富的遺傳多樣性。野生大豆在黃河三角洲有大面積分布，墾利縣大汶流最多，常形成單一的野生大豆群落［4］。近年來(lái)，對(duì)野生大豆和栽培大豆的比較研究多見(jiàn)于有效成分比較［5］、種子貯藏蛋白研究［6］、生化及分子生物學(xué)分析［7、8］、抗逆性研究［9、10］，而黃河三角洲野生大豆與栽培大豆同工酶的比較分析尚未見(jiàn)報(bào)道。

同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，特異的基因表達(dá)產(chǎn)生特異的同工酶酶譜。目前同工酶已被廣泛的應(yīng)用于植物系統(tǒng)演化研究、種質(zhì)資源的鑒定及親緣關(guān)系的研究等方面，都取得了良好的效果［11］。本實(shí)驗(yàn)利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析東營(yíng)市河口區(qū)的野生大豆和山東4個(gè)栽培大豆的過(guò)氧化物酶和酯酶同工酶酶譜特征，從而有助于進(jìn)一步了解野生大豆與栽培大豆之間的親緣關(guān)系及進(jìn)化，為野生大豆資源的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

野生大豆采自黃河三角洲東營(yíng)市河口區(qū)濱海濕地，栽培大豆魯豆1、魯豆10、河豆12和中黃20均購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。上述材料的種子播種于藥用植物園。所有材料經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 種子萌發(fā)后，同一時(shí)間取其新鮮幼嫩葉片0.5g，加1mL提樣緩沖液和少量石英砂，在冰浴中研成勻漿，以2mL提取液分幾次洗入離心管，然后在4℃以8000r/min離心10min，取上清液，加入等量40%蔗糖溶液，搖勻，置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 電泳 采用雙面垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，2種同工酶分離膠濃度均為7.5%，濃縮膠濃度均為3%。點(diǎn)樣30uL，0.1%溴酚藍(lán)作為前沿指示劑，pH 8.3Tris-甘氨酸緩沖液作為電極緩沖液。于4℃冰箱中220V電壓條件下電泳，待指示劑距玻璃板末端1.0cm處停止電泳。

1.2.3 染色 POD同工酶采用醋酸聯(lián)苯胺法（4mL聯(lián)苯胺貯液+18mL H2O+2滴 H2O2）染色，常溫下染色5min左右，水沖洗后照相。EST同工酶采用醋酸奈酯-堅(jiān)牢藍(lán)RR鹽法（α-醋酸奈酯25mg，β-醋酸奈酯25mg，堅(jiān)牢藍(lán)RR 50mg+少許丙酮+75mL pH 6.5的磷酸緩沖液）染色，常溫下染色25min左右，水沖洗后照相。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 依據(jù)電泳照片，記錄數(shù)據(jù)，求出相對(duì)遷移率和相似系數(shù)。酶帶的相對(duì)遷移率（Rf）＝酶帶的遷移距離/溴酚藍(lán)的遷移距離；同工酶酶譜間相似系數(shù)c＝2w/（a＋b），其中c為酶譜間相似系數(shù)，w為A和B兩個(gè)分類群相同的酶帶數(shù)，a為分類群A在酶譜中的酶帶數(shù)，b為分類群B在酶譜中的酶帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 POD同工酶

野生大豆與栽培大豆的過(guò)氧化物酶同工酶譜見(jiàn)圖1。

從圖1可知，野生大豆與栽培大豆的過(guò)氧化物同工酶譜型存在差異。栽培大豆共有9條酶帶，而野生大豆共有6條酶帶。根據(jù)泳動(dòng)速率，酶譜可明顯分為2個(gè)部分，即慢區(qū)（S）和快區(qū)（F）。慢區(qū)Rf在0.021～0.277，快區(qū) Rf在 0.447～0.534（見(jiàn)表 1）。其中S1、S2為強(qiáng)帶，其余多為弱帶。S1、S2、S3、S5、S6、S7和F1、F2、F3為栽培大豆所有，S1、S2、S4、S6、S7和 F1為野大豆所有，即 S1、S2、S6、S7和 F1是大豆的特征譜帶，S4是野生大豆獨(dú)有的，而 S3、S5、F2、F3是栽培大豆獨(dú)有的譜帶。

表1 過(guò)氧化物酶帶的遷移率

圖1 野生大豆與栽培大豆過(guò)氧化物酶同工酶圖譜

2.2 EST同工酶

野生大豆與栽培大豆的酯酶同工酶譜見(jiàn)圖2。

表2 酯酶帶的遷移率

圖2 野生大豆與栽培大豆酯酶同工酶圖譜

從圖2可以看出，野生大豆與栽培大豆的酯酶同工酶譜也存在不同。栽培大豆在慢區(qū)和快區(qū)各有2條 帶 ， 分 別 為 S1、S2和 F1、F2。Rf值 分 別 為0.146，0.188，0.583和 0.646（見(jiàn)表 2），而野生大豆共有3條酶帶。S1、S2、F1為野生大豆和栽培大豆所共有的弱帶，F(xiàn)2是栽培大豆獨(dú)有的譜帶，而野生大豆沒(méi)有。

2.3 基于同工酶酶譜的相似系數(shù)分析

酶譜相似系數(shù)的大小表示品種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)分析可得，野生大豆與栽培大豆過(guò)氧化物酶同工酶酶譜的相似系數(shù)為0.667，酯酶同工酶酶譜的相似系數(shù)為0.714。從這兩種酶譜分析來(lái)看，野生大豆與栽培大豆之間的親緣關(guān)系比較近。

3 結(jié)論

野生大豆和栽培大豆不僅在植物外部形態(tài)和生境上存在差別，而且同工酶酶譜也存在明顯差別。在本次實(shí)驗(yàn)中，野生大豆與栽培大豆過(guò)氧化物同工酶譜存在比較明顯的差異，酶帶分離效果較好。酯酶同工酶也存在區(qū)別，但效果不如過(guò)氧化物酶同工酶。過(guò)氧化物同工酶是由單基因決定的同工酶，它在一定程度上能較好的反映不同種源間的遺傳差異和親緣關(guān)系，而且利用其進(jìn)行物種的輔助鑒定，是一種較為方便、有效的手段。因此過(guò)氧化物酶同工酶譜可以作為野生大豆和栽培大豆進(jìn)化和類型鑒定的參考依據(jù)。但遺傳差異不僅僅體現(xiàn)在一兩種酶上，如果能同時(shí)對(duì)更多的同工酶進(jìn)行分析，則更能全面的反映遺傳差異。

野生大豆與栽培大豆的過(guò)氧化物酶和酯酶同工酶譜雖然都存在差異，但更多的是相似性，二者之間的酶譜相似系數(shù)說(shuō)明二者親緣關(guān)系較近，但也有各自的遺傳基礎(chǔ)。

［1］林镕，俞德浚，吳征鎰，等．中國(guó)植物志［M］．北京：科學(xué)出版社，2005．

［2］Doyle J J，Doyle J L.Ribosomalgene variation in soybean(Glycine)and its relatives ［J］．Theoretical and Applied Genetics，1985，70（4）：369-374．

［3］於丙軍，羅慶云，曹愛(ài)忠，等.栽培大豆和野生大豆耐鹽性及離子效應(yīng)的比較［J］植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2001，101:25-29．

［4］吳立新．野大豆栽培技術(shù)與利用［J］.四川草原，2004，106（9）：59-60．

［5］周三，關(guān)崎春雄，岳旺，等．野生大豆、黑豆和大豆的異黃酮類成分比較［J］．2008，27（2）：315-319．

［6］李春梅，楊守萍，蓋鈞鎰，等．野生大豆與栽培大豆種子差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究［J］．生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007，34，（12）：1296-1302.

［7］劉潤(rùn)堂，賈煒瓏，溫琪汾，等．栽培大豆、野生大豆和半野生大豆酯酶同工酶的研究［J］．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，15（3）：235-237．

［8］趙洪錕，王玉民，李啟云，等．中國(guó)不同緯度野生大豆和栽培大豆 SSR 分析［J］．大豆科學(xué)，2001，20（3）：172-176.

［9］付暢，關(guān)旸，徐娜．鹽脅迫對(duì)野生和栽培大豆中抗氧化酶活性的影響［J］．大豆科學(xué)，2007，26（2）：144-148．

［10］於丙軍，羅慶云，曹愛(ài)忠．栽培大豆和野生大豆耐鹽性及離子效應(yīng)的比較［J］．植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2001，10（2）：25-29．

［11］劉海學(xué)，王罡，季靜，劉鵬，等．16個(gè)向日葵品種過(guò)氧化物酶同工酶分析［J］．中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2007，29（2）：64-67．