武江,馬林,韓巨才,王美琴

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷 030801)

Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對番茄體內(nèi)防御性酶活性的影響

武江,馬林,韓巨才,王美琴

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷 030801)

為明確植物內(nèi)生放線菌對植物體內(nèi)防御性酶活性的影響,以植物內(nèi)生放線菌Lj20和St24發(fā)酵液粗提物處理番茄植株,測定其根、莖、葉中過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化。測定結(jié)果表明,用Lj20和St24粗提物處理番茄植株后,除SOD處理和對照沒有明顯差異外,CAT、PPO和POD酶的活性都有所增強(qiáng),但酶活性隨時(shí)間變化規(guī)律各不相同。其中Lj20粗提物處理的番茄莖和葉中PPO的活性增加最明顯,在測定時(shí)間內(nèi)呈直線上升趨勢。這表明Lj20和St24的代謝物不僅對病原菌具有直接抑制作用,而且可通過提高植物體內(nèi)防御性酶活性來提高植物的抗病性。

植物內(nèi)生放線菌;防御性酶活性;番茄植株

植物內(nèi)生菌是定殖在健康植物組織內(nèi),并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物,包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生放線菌和內(nèi)生細(xì)菌[1,2]。自Stierle A等[3]1993年從短葉紫杉中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌后,有關(guān)內(nèi)生菌的研究引起了人們越來越多的興趣。近年來的大量研究表明,內(nèi)生菌廣泛存在于絕大多數(shù)植物中,開發(fā)與應(yīng)用潛力巨大。其中,放線菌是產(chǎn)生抗生素及多種生物抗性物質(zhì)的重要微生物資源,廣泛存在于植物體內(nèi)[4,5]。

隨著有機(jī)和綠色食品的發(fā)展,利用微生物進(jìn)行生物防治越來越受到人們的重視,特別是植物抗病性的誘導(dǎo)已成為一個(gè)重要的發(fā)展方向和現(xiàn)代農(nóng)藥的新理念[6]。目前,國內(nèi)外關(guān)于植物內(nèi)生菌在植物病害防治中應(yīng)用的報(bào)道多集中于內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌,關(guān)于內(nèi)生放線菌應(yīng)用報(bào)道較少。前期研究工作已證實(shí)植物內(nèi)生放線菌St24和Lj20對番茄灰霉病菌、葉霉病菌等多種病原菌具有抑制作用,盆栽試驗(yàn)證實(shí)具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景[7]。為進(jìn)一步探究內(nèi)生放線菌的防病機(jī)制,本文測定了St24和Lj20代謝物對番茄植株內(nèi)防御酶活性的影響,為進(jìn)一步開發(fā)該菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物內(nèi)生放線菌Lj20和St24菌株由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。番茄灰霉病菌為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2 方法

1.2.1 植株處理

制備濃度為1×105mol?mL-1的灰霉病菌孢子懸浮液,在番茄幼苗三、四葉時(shí)接種,30℃保濕光照培養(yǎng)3 d,用St24和Lj20菌株發(fā)酵液粗提物葉面噴霧處理,粗提物濃度為500 mg?L-1,在噴霧12 h及 2、4 、6、8 d 后分別測定植株根 、莖、葉的過氧化氫酶、多酚氧化酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性,以清水為對照。

1.2.2 酶液提取

準(zhǔn)確稱量植物根、莖、葉各0.3 g,冰上剪碎,加0.05 mol?L-1pH6.0的磷酸緩沖液3.0 mL,0.03 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),加少量石英砂,在冰浴中研磨成勻漿,于10000 r?min-14℃離心 10 min,取上清液,即為粗酶液。

1.2.3 酶活性測定

CAT和PPO的測定方法見鄒崎《植物生理生化試驗(yàn)指導(dǎo)》[8],POD的測定方法見湯章成《現(xiàn)代植物生理學(xué)試驗(yàn)指南》[9],SOD的測定方法見王金勝《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)研究技術(shù)》[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫酶(CAT)的活性變化

2.1.1 植株根內(nèi)CAT的活性變化(圖1)

圖1 Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對植株根內(nèi)CAT活性影響Fig.1 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on CAT activity in roots

從圖1可看出,經(jīng)Lj20發(fā)酵液粗提物處理后,番茄植株根中CAT活性在處理當(dāng)天和處理后4 d的酶活性高于對照,其中處理當(dāng)天的活性最大,酶活性為2.93 U?g-1。而在其它測定時(shí)間內(nèi)酶活性都小于對照酶活性。經(jīng)St24發(fā)酵液粗提物處理番茄植株根,CAT活性在處理12 h、4 d和6 d時(shí)酶活性都高于對照,6 d時(shí)達(dá)到最高峰,為5.3 U?g-1。到8 d時(shí),兩個(gè)處理和對照酶活性相近,差異不顯著。

2.1.2 植株莖內(nèi)CAT的活性變化(圖2)

圖2 Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對植株莖內(nèi)CAT活性影響Fig.2 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on CAT activity in stems

從圖2可以看出,經(jīng)過Lj20和St24發(fā)酵液粗提物處理后,隨時(shí)間延長植株莖的酶活性變化都較小。經(jīng)Lj20發(fā)酵液粗提物處理后的番茄植株,莖中的CAT活性只有在處理后6 d時(shí)略高于對照組酶活性,在其它測定時(shí)間內(nèi)均小于對照酶活性。而經(jīng)St24發(fā)酵液粗提物處理后,酶活性只有在2 d時(shí)低于對照,其它時(shí)間都高于對照。

2.1.3 植株葉內(nèi)CAT的活性變化(圖3)

圖3 Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對植株葉內(nèi)CAT活性影響Fig.3 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on CAT activity in leaves

從圖3可以看出,經(jīng)Lj20發(fā)酵液粗提物處理后的番茄植株,葉中的CAT活性在處理當(dāng)天顯著高于對照,但在之后6 d都低于對照水平,在8 d時(shí)略高于對照。經(jīng)St24發(fā)酵液粗提物處理的番茄葉,在處理當(dāng)天與對照相比無明顯差異,至測定第四天酶活性達(dá)峰值,為9.1 U?g-1,且高于對照,而在其它測定時(shí)間內(nèi)都低于對照。

2.2 多酚氧化酶(PPO)的活性變化

2.2.1 植株根內(nèi)PPO的活性變化(圖4)

圖4 Lj20和 St24發(fā)酵液粗提物對植株根內(nèi)PPO活性影響Fig.4 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on PPO activity in roots

從圖4可以看出,Lj20發(fā)酵液粗提物處理番茄后,植株根內(nèi)PPO活性基本保持平衡,8 d內(nèi)的變化不大。經(jīng)St24發(fā)酵液粗提物處理后,植株根內(nèi)的PPO活性在處理前4 d活性變化趨勢與對照相同,在2 d達(dá)到最高,且顯著高于對照水平,最大值為120 U?g-1;到6 d時(shí)達(dá)到另一活性高峰,為90 U?g-1,且明顯高于對照酶活性。

2.2.2 植株莖內(nèi)PPO的活性變化(圖5)

圖5 Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對植株莖內(nèi)PPO活性影響Fig.5 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on PPO activity in stems

從圖5可以看出,用Lj20和St24發(fā)酵液粗提物處理植株后,莖內(nèi)的PPO活性都呈增長趨勢,且Lj20發(fā)酵液粗提物處理后 PPO活性始終大于St24發(fā)酵液粗提物處理后的酶活性。但在4 d以后兩個(gè)處理組都與對照組酶活性接近。

2.2.3 植株葉片內(nèi)PPO的活性變化(圖6)

圖6 Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對植株葉內(nèi)PPO活性影響Fig.6 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on PPO activity in leaves

從圖6可看出,處理組葉片PPO活性在12 h時(shí)均低于對照組,到8 d時(shí)三組葉片的酶活性接近。Lj20發(fā)酵液粗提物處理番茄后,葉片內(nèi)的PPO活性呈直線上升趨勢,至8 d達(dá)到最高,酶活性為38 U?g-1,且略高于對照水平;經(jīng)St24發(fā)酵液粗提物處理后,葉片內(nèi)的PPO活性迅速增加,在處理2 d達(dá)到最高,達(dá)到35 U?g-1,且顯著高于對照水平,從處理后4 d開始,活性變化與對照組相同,且略低于對照。

2.3 過氧化物酶(POD)的活性變化

2.3.1 植株根內(nèi)POD的活性變化(圖7)

圖7 Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對植株根內(nèi)POD活性影響Fig.7 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on POD activity in roots

從圖7可以看出,經(jīng)Lj20發(fā)酵液粗提物處理后的番茄植株根內(nèi)POD酶活性的變化,只有在處理后6 d時(shí)低于對照,其它時(shí)間都高于對照。經(jīng)St24發(fā)酵液粗提物處理后,番茄植株根中的POD活性都高于對照,在處理當(dāng)天即達(dá)到最大值,為2982.22 U?g-1,在處理后的四天中呈較快下降趨勢,并在第四天降至最低,在隨后的時(shí)間中,POD活性持續(xù)增加。

2.3.2 植株莖內(nèi)POD的活性變化(圖8)

圖8 Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對植株莖內(nèi)POD活性影響Fig.8 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on POD activity in stems

從圖8可以看出,Lj20發(fā)酵液粗提物處理后的番茄植株莖內(nèi)的 POD酶活性在4 d時(shí)活性最低,且低于對照,在處理后的其他時(shí)間內(nèi)都明顯高于對照,處理后8 d時(shí)達(dá)到最大值,為1 040 U?g-1。St24發(fā)酵液粗提物處理的番茄植株莖的POD活性在試驗(yàn)的前6 d都明顯高于對照,在8 d時(shí),酶活性下降到了對照數(shù)值以下。

2.3.3 植株葉內(nèi)POD的活性變化(圖9)

圖9 Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對植株葉內(nèi)POD活性影響Fig.9 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on POD activity in leaves

由圖9可以看出,Lj20發(fā)酵液粗提物處理后的番茄葉中的POD活性在處理前6 d,酶活性變化不大,在6～8 d,酶活性增加,達(dá)到最大值316.44 U?g-1。St24發(fā)酵液粗提物處理的番茄植株后的酶活性都高于對照酶活性,6 d時(shí)活性最大,為562.67 U?g-1。

2.4超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化

對照組和處理組根、莖、葉的SOD活性變化相同,說明Lj20和St24發(fā)酵液粗提物對植株體內(nèi)的SOD酶活性沒有影響。

3 結(jié)論與討論

寄主植物受到病源菌侵染后,其防御酶系會(huì)被激活。植物體內(nèi)的SOD是一種典型的誘導(dǎo)酶,可以清除O2?-,減少對植物的毒害作用。植物在逆境下受到傷害以及植物對逆境的抵抗能力往往與體內(nèi)SOD活性水平有關(guān),抗逆性強(qiáng)的植物SOD活性降低幅度小或相對穩(wěn)定,有時(shí)甚至升高。CAT和POD是細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成部分,能有效清除生物體內(nèi)的過氧化氫對細(xì)胞的氧化作用,從而增強(qiáng)植物對各種不良環(huán)境的抵抗能力。PPO廣泛存在于植物中,已有研究報(bào)道,健康葉片中PPO活性與作物抗病性呈顯著相關(guān)。在正常情況下,PPO和底物是分開的,當(dāng)細(xì)胞受到輕微破壞組織衰老時(shí),有些細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體時(shí),PPO和底物接觸發(fā)生反應(yīng),將酚氧化成對微生物有毒的醌,可防止植物感染。這些酶的活性變化可反應(yīng)某一時(shí)間段內(nèi)植物體內(nèi)代謝的變化情況[11,12]。

本研究結(jié)果表明經(jīng)Lj20和St24發(fā)酵液粗提物處理番茄植株后CAT、POD活性均表現(xiàn)出明顯的波動(dòng),其中根、莖、葉中CAT活性在處理前期均低于對照,可能是因?yàn)榧?xì)胞受到活性氧的毒害,損害了CAT使其活性下降,但POD在處理后始終保持較高的活性,從而緩解了活性氧對CAT的毒害作用。處理后期CAT、POD活性明顯增強(qiáng)并逐漸達(dá)到高峰,此階段CAT、POD在清除H2O2對植物毒害方面發(fā)揮重要作用,細(xì)胞內(nèi)O2?-積累很少。

而SOD活性與對照無明顯差異,這可能是由于處理后植物體內(nèi)的一些可溶性蛋白首先參與到防御系統(tǒng)中,蛋白質(zhì)含量增加以抵御植物受毒素的傷害,但之后由于外界脅迫時(shí)間的增加,毒素濃度逐漸升高,蛋白質(zhì)合成受阻,同時(shí)相對加速了一些儲藏蛋白質(zhì)的水解使蛋白質(zhì)含量降低,從而抗逆能力降低,植物體內(nèi)活性氧含量升高。也可能是PPO活性變化的影響,因?yàn)镻PO活性在處理后變化比較明顯,一直呈上升趨勢并在第8天達(dá)到峰值,說明經(jīng)Lj20和St24發(fā)酵液粗提物處理后植株體內(nèi)的代謝活動(dòng)不斷增強(qiáng),從而提高植物抵抗外界病原菌感染的能力,具體原因有待于進(jìn)一步分析。

隨著外界脅迫程度的增強(qiáng),SOD、POD、CAT、PPO相互協(xié)調(diào),組成植物體內(nèi)完善的抗氧化保護(hù)系統(tǒng),使活性氧對細(xì)胞的損害程度維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)。本試驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)Lj20和St24發(fā)酵液粗提物處理后,番茄植株體內(nèi)各種酶的活性顯著發(fā)生變化,說明寄主植物受到病源菌侵染后,其防御酶系被激活,起到調(diào)節(jié)并恢復(fù)植物體內(nèi)各種生理生化活動(dòng)的作用,維持植物健康生長。因此,Lj20和St24菌株除對多種病原菌都有很好的抑制作用,在適當(dāng)?shù)臐舛认乱部勺鳛榧せ钪参锟共C(jī)制的誘導(dǎo)劑,從而提高作物的抗逆能力。有關(guān)兩菌株是否具有提高寄主對病原菌侵染的防衛(wèi)能力有待進(jìn)一步研究。

[1]Hallmann J,QuadtHall mann A,Mahaffee WF,et al.Bacterial Endophytes in argricultural rops[J].Can J Microbiol,1997,43:895-914.

[2]Saracchi M,Sardi P.Growth promoter streptomyces employed in seed bacterization institute of plant pathology[M].Milano,Italy,1992:212-217.

[3]Stierle A,Strobel G,Stierle D.Taxol and taxane production by T axomy ces andreanae,an endophytic fungus of Pacific yew[J].Science,1993,260:214-216.

[4]Cao L,Qin Z,You J,et al.Isolation and characterization of endophytic Streptomy ces strains from surface-sterilized tomato(Lycopersicon esculentum)roots[J].Lett Appl Microbiol,2004,39:425-430.

[5]Igarashi Y,Minra SS,Fujita T,et al.Pterocidin,a cytotoxic compound from the endophytic Streptomyces hygroscopicus[J].Autibiet,2006,59:193-195.

[6]吳霞,張一賓.作物抗御病害新技術(shù)——由微生物誘導(dǎo)作物全株抗性[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2004,4:28-30.

[7]馬林,陳紅兵,韓巨才,等.植物內(nèi)生放線菌Lj20的鑒定及其抗真菌物質(zhì)的合成[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(7):900-904.

[8]鄒崎.植物生理生化試驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1993:86-89.

[9]湯章城,魏家綿,陳因.現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第一版)[M].北京:科學(xué)出版社,1999:264-265.

[10]王金勝.農(nóng)業(yè)生物化學(xué)研究技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001:114-119.

[11]M adi L,Katan J.Penecillium janczewskiiand its metabolites,applied to leaves,elicit sy stemic acquired resistance to stem rot causedRhizoctonia solani[J].Phy siological and Molecular Plant Pathology,1998,53:163-175.

[12]王忠.植物生理學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003:422-423.

The Effects of Extracts of Lj20 and St24 Metabolites on the Protective Enzyme Activities in Tomato Plants

WU Jiang,MA Lin,HAN Ju-cai,Wang Mei-qin
(College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China)

The protective enzyme activities in roots,stems and leaves of tomato seedlings were detected after treatment with extracts of endophytic actinomycetes St24 and Lj20 metabolites.The results showed that extracts of St24 and Lj20 metabolites could obviously increase the activities of PPO,POD and CAT except that of SOD,but the regularities for change of three enzymes were different with time.The effect of Lj20 metabolites extracts on PPO in stem and leaf was greatest.After treatment,the activity showed an upward trend in a straight line.Therefore,it is considered that the metabolites of St24 and Lj20 can not only directly inhibit pathogens,but also improve the disease resistance of tomato seedlings to a certain extent by prompting the activity of protective enzymes.

Endophytic actinomycetes;Protective enzyme activities;Tomato seedlings

S432.4+3

A

1671-8151(2010)01-0024-05

2009-09-07

2009-12-04

武江(1984-),女(漢),山西太原人,碩士研究生,主要從事園藝植物病害方面的研究。

韓巨才,教授,博士生導(dǎo)師。E-mail:sxndhjc@yahoo.com.cn

山西省自然基金(2008011066);山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2007031039);山西省留學(xué)歸國基金(2007061,2009043)

(編輯:馬榮博)