張雪輝

（邢臺(tái)學(xué)院生物化學(xué)系，河北邢臺(tái)，054001）

西葫蘆灰霉病主要是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinereaPers.）侵染引起的。該病原菌寄主廣泛，可引起多種蔬菜、果樹和花卉植物的灰霉病[1]，已成為設(shè)施蔬菜栽培的限制性障礙。生產(chǎn)上以化學(xué)防治為主，但由于農(nóng)藥大量長期的使用，不僅容易使病菌產(chǎn)生抗藥性，還污染環(huán)境，對(duì)人畜造成了極大的為害。本研究旨在對(duì)該病的拮抗細(xì)菌的抗菌物質(zhì)產(chǎn)生條件進(jìn)行研究，旨在為開發(fā)生物農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)，從而為西葫蘆的綠色生產(chǎn)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

拮抗細(xì)菌XTB-108由邢臺(tái)學(xué)院生物化學(xué)系微生物實(shí)驗(yàn)室從污水中分離所得；西葫蘆灰霉病菌（Botrytis cinerea），微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存；PDA；LB培養(yǎng)基；LB培養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

①拮抗細(xì)菌母液的制備 將試管保存的菌種轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基平板上活化，24 h后挑取一環(huán)接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，搖床上30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，制成5.2×108cfu/mL的懸浮液，稱為母液。

②最佳發(fā)酵時(shí)間的測(cè)定 取母液7 mL加入到盛有100 mL LB培養(yǎng)液的三角瓶中，在30℃，180 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)， 分別在 0，8，16，24，32，40，48，56，64，72 h取出，離心過濾，采用牛津杯法進(jìn)行生物測(cè)定[2]，每個(gè)牛津杯加入20 μL培養(yǎng)液，以無菌水作對(duì)照，在30℃下培養(yǎng)72 h，測(cè)定抑菌活性。

③不同接種量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響 將母液分別取 0.5，1，3，5，7，10，15，20，30 mL 接種于 100 mL的LB培養(yǎng)液中，搖床上30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后取出，離心、過濾，測(cè)定無菌發(fā)酵液的抑菌活性（同②）。

④培養(yǎng)液初始pH值對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

將培養(yǎng)液用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH分別精確調(diào) pH 值至 4，5，6，7，8，9，10，11， 經(jīng) 121℃高壓濕熱滅菌30 min。取母液7 mL加入到盛有100 mL的LB培養(yǎng)液中，搖床上30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，取出后離心、過濾，測(cè)定無菌發(fā)酵液的抑菌活性（同②）。

⑤培養(yǎng)方式對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響 取母液7 mL加入到盛有100 mL的LB培養(yǎng)液中，設(shè)置靜止、間歇振蕩（12 h/d）和振蕩（24 h/d，180 r/min）3 個(gè)處理，30℃培養(yǎng)，48 h后測(cè)定其無菌濾液的抑菌活性（同②），確定其最佳培養(yǎng)方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳發(fā)酵時(shí)間的測(cè)定

由圖1可知，XTB-108菌株發(fā)酵液開始隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長抑菌活性逐漸提高，培養(yǎng)40~48 h其抑菌活性驟然升高，48h抑菌活性達(dá)到最高為64.67%，隨后抑菌活性開始下降。所以最佳發(fā)酵時(shí)間定為48～56 h，以下培養(yǎng)時(shí)間均為發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

表1 不同pH值對(duì)XTB-108菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的影響

表2 不同培養(yǎng)方式對(duì)XTB-108菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的影響

2.2 不同接種量在培養(yǎng)48 h時(shí)的抑菌活性

從圖2可知，不同接種量對(duì)抑菌活性有一定的影響。在加入量為0.5~7 mL時(shí)，隨著接種量的增加，發(fā)酵濾液的抑菌活性增高，加入7 mL時(shí)，抑菌活性達(dá)最高（64.32%），隨后接種量越大，抑菌活性開始降低。所以本試驗(yàn)采用每100 mL培養(yǎng)基中加入7 mL母液的接種量為最好。

2.3 培養(yǎng)液初始pH值對(duì)XTB-108菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

由表1可以看出，發(fā)酵液的初始pH值對(duì)XTB-108菌株的發(fā)酵液抑菌活性影響較大。在pH值4～7時(shí)隨著pH值的增大，抑菌活性增強(qiáng)，在pH值為7時(shí)抑制活性達(dá)到最大值，在pH值7～8時(shí)保持平穩(wěn)，隨后活性驟然降低。說明在酸性條件下不利于抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生，同時(shí)堿性過強(qiáng)直接影響著該菌的生長，也不利于抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生，只有在pH值7～8的弱堿性條件下才有利于產(chǎn)物活性成分的提高。

2.4 培養(yǎng)方式對(duì)XTB-108菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

由表2可見，培養(yǎng)方式對(duì)XTB-108菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的影響較大。振蕩培養(yǎng)有利于抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生，其無菌濾液對(duì)灰霉菌的抗菌活性 （抑菌率64.20%）高于間歇振蕩培養(yǎng)（抑菌率47.50%）和靜止培養(yǎng)（0%）。值得關(guān)注的是，靜止培養(yǎng)的發(fā)酵液對(duì)灰霉菌無任何影響，表明該菌抑菌物質(zhì)需要有充足的氧的供應(yīng)才能產(chǎn)生。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在30℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)48 h，每100 mL LB培養(yǎng)液中接種發(fā)酵液母液7 mL，培養(yǎng)液的初始pH值為7～8時(shí)的培養(yǎng)基，是XTB-108產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最佳條件。但該菌株是通過室內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)和溫室內(nèi)西葫蘆苗期生物測(cè)定篩選出的拮抗菌，對(duì)其抗菌物質(zhì)產(chǎn)生條件也僅是通過室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)測(cè)得。還應(yīng)進(jìn)一步對(duì)其最佳防治劑量、最佳防治時(shí)間及最佳定植條件等進(jìn)行研究，使得生產(chǎn)者在使用生防菌時(shí)，能科學(xué)施用，人為地調(diào)控田間及棚室的環(huán)境因素，充分發(fā)揮其生防潛能。

[1]韓兆均.植物保護(hù)學(xué)通論[M].北京：高等教育出版社，2001.

[2]李俊，紀(jì)明山，劉浩強(qiáng)，等.番茄灰霉病拮抗細(xì)菌R26抗菌物質(zhì)產(chǎn)生條件的研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（2）：105-108.

[3]韓斯琴，徐梅，白震，等.番茄灰霉病拮抗菌D2-4發(fā)酵條件的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（1）：93-98.