張建軍，胥華偉，周曉垂，王玉琪，彭新湘

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子植物生理研究室，廣東廣州510642;2河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽471003)

乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase，GLO)是光呼吸代謝的關(guān)鍵酶［1-3］，GLO催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，也可以催化乙醛酸氧化生成草酸［1］.自1948年蘇聯(lián)學(xué)者首次報(bào)道GLO以來，對(duì)GLO的研究主要集中在其分子結(jié)構(gòu)和催化特性方面［4-5］.光呼吸途徑中通過GLO反應(yīng)產(chǎn)生大量H2O2，H2O2在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及誘導(dǎo)抗逆性等方面都具有重要作用［6］;生物信息學(xué)的分析表明，水稻中存在著多個(gè)可能編碼GLO的基因，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物生理實(shí)驗(yàn)室利用誘導(dǎo)反義RNA技術(shù)研究了水稻乙醇酸氧化酶基因(OsGLO1)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GLO活性的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致光合速率的下降，且二者呈明顯的線性關(guān)系［7］，說明OsGLO1是調(diào)控GLO的關(guān)鍵基因之一.為了深入研究GLO的功能，本研究構(gòu)建了OsGLO1的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)并純化后免疫新西蘭白兔，制備相應(yīng)的多克隆抗體，以水稻 Oryza sativa、擬南芥Arabidopsis thaliana等植物蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果表明該抗體的特異性強(qiáng)，可真實(shí)反應(yīng)植物體內(nèi)GLO的表達(dá)情況.該特異性抗體的獲得為進(jìn)一步深入研究GLO在調(diào)控光呼吸及抗逆性等方面的作用奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker DL2000、低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)和RNasin為TaKaRa公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV和高保真Taq酶KOD-PLUS為Toyobo公司產(chǎn)品;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、氨芐青霉素、IPTG、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔二抗為Sigma公司產(chǎn)品;Gel Extraction Mini Kit為上海生物工程有限公司產(chǎn)品;原核表達(dá)質(zhì)粒pET23d(+)及宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)由本研究室保存.

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)預(yù)測(cè)的OsGLO1的序列(GenBank登錄號(hào)為AF022740)設(shè)計(jì)引物，OsGLO1-F:5'-GATAGAATTCCAGGGTTCACAAGGCAGGAG-3'(下劃線處為EcoRⅠ的酶切位點(diǎn))，OsGLO1-R:5'-TCACCTCGAGGATTAAGAGCATGAACGACC-3'(下劃線處為XhoⅠ的酶切位點(diǎn))，引物由上海生物工程有限公司合成.

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及序列分析

以粳稻品種中花11葉片為材料，通過RT-PCR擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，58℃退火40 s，68℃延伸1.5 min，28個(gè)循環(huán).PCR產(chǎn)物和pET23d(+)分別以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接并轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切篩選鑒定陽性菌落，含陽性重組質(zhì)粒的菌液送交上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET23d-OsGLO1.

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及重組蛋白的純化

37℃條件下，將含有重組質(zhì)粒pET23d-OsGLO1的E.coli BL21(DE3)培養(yǎng)至D600nm約為0.5，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG開始誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，于30 ℃分別培養(yǎng) 1、2、4、6 和 12 h，分別取適量菌液于6 000 r/min下離心15 min，收集菌體，重懸菌體并進(jìn)行超聲波破碎，然后4℃條件下，12 000 r/min離心15 min分別收集上清液和沉淀，各取少量進(jìn)行SDS-PAGE分析.將超聲波破碎后離心收集的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，切下目的條帶并于電洗脫儀上低溫洗脫后透析，最終得到純化的重組蛋白.

1.5 抗體制備

用考馬斯亮藍(lán)G-250［8］對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行定量，然后加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100℃處理5 min后上樣進(jìn)行SDS-PAGE.將純化回收的目的蛋白與弗氏完全佐劑以體積比1∶1混合，充分乳化后采用皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行初次免疫;然后每隔7 d，將純化的蛋白與弗氏不完全佐劑以體積比1∶1混合，充分乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共免疫4次;免疫結(jié)束后10～15 d取血，分離出血清，-20℃保存?zhèn)溆?

1.6 Western-blot分析

分別稱取水稻、菠菜Spinacia oleracea、莧菜Amaranthus palmeri、擬南芥和菜心 Brassica campestris葉片1 g，加入一定體積的提取緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl，25 mmol/L EDTA，pH7.5)，勻漿后，12 000 r/min離心10 min，上清液中的蛋白先定量，然后取適當(dāng)體積的蛋白樣品與等體積的2×SDS上樣緩沖液混勻，100℃處理5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳.電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(NC)上，并按照常規(guī)方法進(jìn)行Western-blot.

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆與原核表達(dá)載體pET23d-Os-GLO1的構(gòu)建

所擴(kuò)增片段為OsGLO1的完整編碼框，用RTPCR方法擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1 100 bp的目的條帶(圖1)，與預(yù)測(cè)大小相符.將PCR產(chǎn)物回收后，以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切目的片段和pET23d質(zhì)粒，連接后轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET23d-OsGLO1.酶切鑒定(圖2)和測(cè)序結(jié)果表明，重組表達(dá)載體上的基因片段與已報(bào)道的OsGLO1(GenBank登錄號(hào)為AF022740)的相似性為100%，表明已成功構(gòu)建OsGLO1的原核表達(dá)載體.

圖1 RT-PCR擴(kuò)增OsGLO1產(chǎn)物的凝膠電泳分析Fig.1 Electrophoresis of OsGLO1 amplified by RT-PCR

圖2 重組質(zhì)粒pET23d-OsGLO1的限制性酶切分析Fig.2 Restriction digestion analysis of recombinant plasmid pET23d-OsGLO1

2.2 水稻OsGLO1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

含有重組表達(dá)載體的E.coli BL21(DE3)加入0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間，收集菌體并進(jìn)行超聲波破碎后，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示沉淀中有明顯的重組蛋白特異條帶，而上清中則無此條帶;IPTG誘導(dǎo)2 h后即有目的蛋白被誘導(dǎo)(圖3);重組蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量約為40 000(OsGLO1相對(duì)分子質(zhì)量38 000，His標(biāo)簽蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為1 500).表明該OsGLO1基因在誘導(dǎo)條件下得到了表達(dá)，且以包涵體的形式存在.進(jìn)而利用超聲波破碎法反復(fù)破碎誘導(dǎo)的菌體，然后收集包涵體，利用SDS-PAGE純化OsGLO1融合蛋白后進(jìn)行透析，獲得純度較高的重組蛋白(圖3).

圖3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of induced and purified recombinant proteins

2.3 OsGLO1融合蛋白的多克隆抗體制備和特異性分析

以O(shè)sGLO1融合蛋白免疫新西蘭白兔4次后采集血液，制備抗血清.Western-blot檢驗(yàn)OsGLO1融合蛋白多克隆抗體的特異性和效果，結(jié)果(圖4)表明未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白沒有免疫印跡，而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)12 h的菌體蛋白，在相對(duì)分子質(zhì)量約39 000的位置有一條明顯的印跡，說明該抗體的特異性較強(qiáng).用不同植物材料葉片蛋白進(jìn)行的Western-blot結(jié)果顯示C3植物材料均有免疫印跡，并且相對(duì)分子質(zhì)量大小吻合;在C4植物莧菜中檢測(cè)不到乙醇酸氧化酶蛋白，可能與C4植物光呼吸較弱，乙醇酸氧化酶蛋白含量較低有關(guān)，進(jìn)一步說明該抗體對(duì)乙醇酸氧化酶蛋白具有較強(qiáng)的特異性.乙醇酸氧化酶是光呼吸代謝的關(guān)鍵酶［1-3］.目前對(duì)GLO生理功能的認(rèn)識(shí)尚停留在“它是植物光呼吸代謝步驟中的一個(gè)關(guān)鍵酶，是光合組織中光促耗氧的主要酶”［4-5］.此外，乙醇酸氧化酶可催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，也可催化乙醛酸氧化生成草酸，這2步反應(yīng)都伴隨著H2O2的產(chǎn)生［1］.有報(bào)道顯示，光呼吸所產(chǎn)生的H2O2可占植物體中總H2O2含量的70%以上，H2O2參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及誘導(dǎo)抗逆性已被廣泛認(rèn)同［6］，GLO催化所產(chǎn)生的H2O2很可能在植物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用［9］;并有報(bào)道表明干旱和鋁毒脅迫可提高GLO活性和誘導(dǎo)基因表達(dá)［10-11］.因此，制備OsGLO1特異性抗體為進(jìn)一步了解乙醇酸氧化酶在光呼吸中的生理功能以及在植物抗逆性中的作用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

圖4 Western-blot分析不同物種中GLO的表達(dá)Fig.4 GLO expression of different species analysed by Western-blot

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