趙愛華，李鳳祥，賈淑珍，寇麗杰，喬來艷，王國治

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BCG-CpG-DNA對A群腦膜炎球菌多糖疫苗的免疫佐劑作用

趙愛華，李鳳祥，賈淑珍，寇麗杰，喬來艷，王國治

100050 北京，中國藥品生物制品檢定所細菌一室

探討免疫佐劑 BCG-CpG-DNA 對 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗的作用。

將不同劑量（5、10、100 μg）的免疫佐劑 BCG- CpG-DNA 與 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗直接混合后，皮下免疫小鼠，與未添加佐劑疫苗比較，ELISA 法檢測抗原特異性 IgG 抗體水平，并分析抗體亞類 IgG1 和 IgG2a 的水平。

BCG-CpG-DNA 能提高 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗特異性抗體 IgG 水平，并能促進抗原特異性抗體亞類的產(chǎn)生，其中佐劑中、高劑量（10、100 μg）實驗組 IgG、IgG2a 水平與未加入免疫佐劑疫苗之間差異有統(tǒng)計學意義。

BCG-CpG-DNA 對 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗有免疫佐劑作用。

BCG-CpG-DNA； 免疫佐劑； A 群腦膜炎球菌多糖疫苗

近年來，CpG-DNA 成為新型免疫佐劑的研究熱點[1-10]。除了人工合成的 CpG 寡核苷酸（CpG ODN），原核生物 DNA 是 CpG-DNA 的主要來源。BCG-CpG-DNA 是從卡介苗（BCG）中提取的菌體 DNA 片段，已經(jīng)證實 BCG-CpG-DNA 富含未甲基化CpG 基序，具有免疫刺激活性[11-12]，對重組的乙肝表面抗原蛋白有免疫佐劑的作用[13-14]。

由于BCG-CpG-DNA 對蛋白質(zhì)抗原有免疫佐劑的作用，通過檢測 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗的抗原特異性抗體水平及其亞型的類別轉(zhuǎn)換，探討B(tài)CG-CpG-DNA 對多糖抗原是否具有免疫佐劑作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

SPF 級 BALB/c 小鼠8~ 10 周，雌性，由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供。BCG-CpG- DNA 由中國藥品生物制品檢定所菌苗室提供。A 群腦膜炎球菌多糖疫苗為上海生物制品研究所產(chǎn)品；96 孔酶標板為美國 Costar 公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠 IgG、IgG1、IgG2a 為美國 Southern Biotechnology Associates.Inc 產(chǎn)公司品。酶標儀為美國 BD 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及免疫 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗與不同劑量的BCG-CpG-DNA 混合，總體積100 μl，頭背部皮下免疫 BALB/c 小鼠，每組12 只，對照組為未添加佐劑的單純疫苗組。多糖疫苗注射量為2.5 μg 每只動物，佐劑低、中、高劑量組分別為5、10、100 μg 每只動物，隔 1 周免疫，共免疫 3 次。

1.2.2 抗多糖抗體及抗體亞型檢測 末次免疫后 7 d，摘眼球取小鼠血液，離心1500′，15 min 分離血清，ELISA 法檢測多糖特異性 IgG 抗體及 IgG 抗體亞型。A 群腦膜炎球菌多糖疫苗包被96 孔酶標板，1 μg/100 μl/孔，4 ℃過夜，1% 牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉 1 h，加入待檢測血清，37 ℃作用 2 h，洗板，加入 HRP 標記的羊抗小鼠 IgG、IgG1、IgG2a，37 ℃作用 1 h，OPD 顯色適當時間，用 2 mol/L H2SO4終止反應并測定吸光度（492）值。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用Minitab 統(tǒng)計軟件處理，< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抗原特異性多糖抗體 IgG 水平

BCG-CpG-DNA 對 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗產(chǎn)生抗原特異性抗體 IgG 的影響見圖 1，添加BCG-CpG-DNA 的各組抗體水平普遍高于未添加佐劑組，隨著佐劑劑量的增加，對應的抗體水平也升高。添加 5、10、100 μg 佐劑的 3 個實驗組抗原特異性的 IgG 水平分別是未添加佐劑組的1.56 倍（0.3870/0.2485）、1.83 倍（0.4545/0.2485）和1.89 倍（0.4700/0.2485），添加 5 μg BCG-CpG- DNA 疫苗組抗體水平與未添加佐劑組之間無統(tǒng)計學差異（= 0.15），添加 10 μg BCG-CpG-DNA 疫苗組抗體水平與未添加佐劑組之間有統(tǒng)計學意義（= 0.034）；添加 100 μg BCG-CpG-DNA 疫苗組抗體水平與未添加佐劑組之間有統(tǒng)計學意義（= 0.000）；3 組添加佐劑組之間的抗體水平無較大差異。

圖 1 ELISA 法檢測 BCG-CpG-DNA對A群腦膜炎球菌多糖疫苗的抗原特異性 IgG 抗體水平的影響

Figure 1 Effect of level specific antibody IgG of BCG-CpG-DNA on group A meningococcal polysaccharide vaccine by ELISA

*：10、100 μg BCG-CpG-DNA 佐劑組的 IgG2a 水平分別與未添加佐劑組比較，有統(tǒng)計學意義（P = 0.0081，P = 0.0048）

Figure 2 Effect of level specific antibody IgG1 and IgG2a of BCG-CpG-DNA on group A meningococcal polysaccharide vaccine by ELISA

2.2 抗原特異性多糖抗體 IgG 亞型

抗原特異性多糖 IgG 抗體亞型檢測結(jié)果見圖 2，添加 BCG-CpG-DNA 后誘導的抗原特異性的 IgG1 抗體水平與未添加佐劑組之間并無統(tǒng)計學意義（> 0.05）。但添加 BCG-CpG-DNA 的各組的 IgG2a 的水平均高于未添加佐劑組，并且隨著佐劑劑量的增加，IgG2a 的水平也升高，添加 5 μg BCG-CpG-DNA 疫苗組的 IgG2a 水平略高于未添加佐劑組，但添加 10、100 μg BCG-CpG-DNA 兩組的 IgG2a 水平與未添加佐劑組之間有統(tǒng)計學意義（< 0.01）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，BCG-CpG-DNA 能提高 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗特異性 IgG 抗體水平，雖然增加的幅度不是特別明顯，但說明該佐劑對A 群腦膜炎球菌多糖疫苗具有免疫佐劑作用；這種結(jié)果也表明，佐劑和抗原的配比可能不是十分合適，還需要進一步的實驗驗證?？乖禺愋远嗵强贵w IgG 亞型檢測結(jié)果表明，BCG-CpG-DNA 對多糖特異性 IgG1 抗體無較大的影響，但對多糖特異性 IgG2a 抗體有較明顯的影響，但相對蛋白類抗原（如乙肝重組蛋白抗原）[10]，BCG-CpG-DNA 對多糖抗原的佐劑作用相對較弱。

免疫佐劑的主要作用是增強免疫反應或減少抗原用量，對 BCG-CpG-DNA 免疫佐劑的研究，除了要研究其有效性，還要研究其通用性，本文通過 BCG-CpG-DNA 對 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗免疫佐劑作用，聯(lián)系前期對乙肝重組蛋白抗原的佐劑作用，用以說明該佐劑對蛋白和多糖類抗原均有佐劑作用，是對其有效性及通用性研究的一部分。根據(jù)目前的研究結(jié)果，100 μg BCG-CpG-DNA 添加到 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗中，產(chǎn)生的抗體水平是單純疫苗組的 1.9 倍，接近 2 倍，理論上在 A 群腦膜炎球菌多糖疫苗中添加佐劑，可以減少抗原用量，若應用于實際，理論上會產(chǎn)生更多的經(jīng)濟效益。另外 BCG-CpG-DNA 促進多糖特異性 IgG2a 水平的提高，理論上更能發(fā)揮疫苗的保護作用。

IgG2a 的類別轉(zhuǎn)換是由 IFN-γ來實現(xiàn)的[15]，IgG2a 是Th1 類免疫反應代表的抗體分子，IgG2a 與巨噬細胞表面高親和力的FcγRI 受體結(jié)合，參與巨噬細胞介導的宿主防御反應，巨噬細胞可以直接消除各種異物，殺傷細胞內(nèi)的病原體。而IgG1 抗體主要介導吞噬細胞（如肥大細胞和噬酸性粒細胞）的防御作用。這說明BCG-CpG-DNA 作為佐劑具有誘導多糖疫苗導向Th1 類免疫反應的趨勢，這在控制細菌感染方面有重要的意義。

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Immunoadjuvant activity of BCG-CpG-DNA on group A meningococcal polysaccharide vaccine

ZHAO Ai-hua, LI Feng-xiang, JIA Shu-zhen, KOU Li-jie, QIAO Lai-yan, WANG Guo-zhi

Author Affiliation: Bacterial vaccine division, National Institute for the Control of Pharmaceutaical and Biological Products, Beijing 100050, China

To study adjuvantity of BCG-CpG-DNA from Mycobacterium bovis strain BCG to group A meningococcal polysaccharide antigen.

Mice were vaccinated s.c. with group A meningococcal polysaccharide vaccine alone and combined with different doses of BCG-CpG-DNA (5, 10, 100 μg), then the humoral response were assessed. antigen-specifec IgG and antigen-specifec IgG isotypes were tested by ELISA and analysis of antibody subclasses IgG1 and IgG2a levels.

BCG-CpG-DNA improved antibody level of antigen-specifec IgG and IgG2a, the middle and high dose (10, 100 μg) ofBCG-CpG-DNA group are statistically significant (< 0.05) vs vaccine controll group respectfly. It means that BCG-CpG-DNA induced Th1typeimmune responses.

BCG-CpG-DNA is a potential new immune adjuvant for group A meningococcal polysaccharide vaccine.

BCG-CpG-DNA; Immune adjuvant; Group A meningococcal polysaccharide vaccine

WANG Guo-zhi, Email: tbtestlab@163.net

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.003

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2006AA02A240）

王國治，Email：tbtestlab@163.net

2009-10-14