曹競(jìng)文 何 慶 張 明 于俊娜 張榕榕 牛文彥

近年來研究發(fā)現(xiàn)，白色脂肪組織可以分泌多種影響人體胰島素敏感性和攝食的脂肪因子及炎癥因子[1]。作為最重要的炎癥介質(zhì)之一，腫瘤壞死因子－α（TNF－α）對(duì)許多細(xì)胞因子的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)在肥胖動(dòng)物模型的血漿中炎性細(xì)胞因子TNF－α表達(dá)水平明顯升高，肥胖患者和2型糖尿?。═2DM）人群血漿中TNF-α水平也明顯升高,因此肥胖和2型糖尿病被認(rèn)為是一種慢性低度的炎癥狀態(tài)[2]。過度表達(dá)的TNF-α在介導(dǎo)胰島素抵抗（IR）中起到了中心介質(zhì)的作用,但是其導(dǎo)致IR的分子機(jī)制目前尚不清楚。本研究旨在探討TNF-α在肥胖-炎癥-IR-T2DM的病理生理過程中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株由加拿大Amira Klip教授惠贈(zèng)。主要試劑：1－甲基－3－異丁基－黃嘌呤（IBMX）、地塞米松、胰島素、TNF-α（美國(guó) Sigma公司）、胎牛血清（ISREAL）、DMEM（北京天潤(rùn)善達(dá)生物科技有限責(zé)任公司）、TRIZOL@（Invitrogen Technoloyies Ins，USA）、DEPC（美國(guó) Sigma公司，天津鼎天生物技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)與分化 使用含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種于培養(yǎng)板中，見圖1。待培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)滿2 d后加入分化液（含0.5 mmol/L的IBMX、0.25 μmol/L的地塞米松、10 mg/L的胰島素）及含10%FBS的DMEM培養(yǎng)48 h。換以含10 mg/L胰島素的培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h。隨后以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化后8 d，90%的3T3-L1細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型。一部分分別在加分化液前（第0天）以及加分化液后的第2、4、6、8天提取總RNA行實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），一部分加入高濃度的TNF-α進(jìn)行處理后，行實(shí)時(shí)定量RT-PCR。

細(xì)胞呈典型的梭形，胞漿中無脂滴，形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似圖1 3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化前光鏡下表現(xiàn)（×10）

1.2.2 脂肪細(xì)胞的處理 將10 μg TNF-α干粉溶于經(jīng)過濾處理的含0.25%牛血清白蛋白（BSA）的PBS緩沖液1 mL中，配制成10 mg/L濃度的TNF-α儲(chǔ)存液。用TNF-α儲(chǔ)存液處理分化成熟的細(xì)胞培養(yǎng)板。6孔板設(shè)定空白對(duì)照和加入等體積含0.25%BSA的PBS緩沖液對(duì)照各1孔，第3~6孔加入TNF-α儲(chǔ)存液，保證TNF-α工作濃度為20 μg/L，設(shè)定作用于成熟脂肪細(xì)胞的時(shí)間分別為0.5、4、8、24 h。每組細(xì)胞均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 將分化成熟的脂肪細(xì)胞和用高濃度TNF-α處理的脂肪細(xì)胞分別以TRIzol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物見表1。反應(yīng)體系：最終反應(yīng)混合物（25 μL），其中含有 2×SYBR Premix EX Taq混合液12.5 μL,0.25 μmol/L上下游引物各 1 μL，cDNA 模板 5 μL，dH2O 5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（×50）0.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性 5 s，57℃退火10 s，72℃延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行熔解曲線分析，反應(yīng)條件為：95℃ 15 s，65 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。熔解曲線分析可觀察擴(kuò)增后產(chǎn)物的特異性，為防止熔解曲線分析結(jié)果呈假陽性，將定量PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)產(chǎn)物分子質(zhì)量大小進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物特異性。結(jié)果判定：記錄目的基因Ct值和內(nèi)參照基因Ct值，根據(jù)實(shí)時(shí)定量RTPCR相對(duì)定量的2-△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)的相對(duì)值，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因。

表1 實(shí)時(shí)定量RT-PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞分化過程中ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA的表達(dá) ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞不表達(dá)，分化第2天開始顯著表達(dá)。ADPN mRNA表達(dá)量隨分化時(shí)間延長(zhǎng)而增加（P<0.05）。PPAR-γ mRNA第4天有所下降，第6天和第8天的表達(dá)量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表 2，圖 2。

2.2 高濃度的TNF-α處理后成熟脂肪細(xì)胞中各目的基因的表達(dá)

2.2.1 ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA的表達(dá) 處理0.5 h后ADPN mRNA表達(dá)水平明顯下降，處理0.5、4、8 h后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)ADPN mRNA表達(dá)水平逐漸下降，處理8 h后降至最低。處理0.5 h后PPAR-γ mRNA表達(dá)水平并未明顯下降，其他各處理組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），處理4 h后降至最低，見表3。

2.2.2 TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 及 IL-1β mRNA的表達(dá) 處理0.5 h后TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯上升，并于處理4 h后達(dá)峰值，處理8 h和24 h較處理4 h后下降，各處理組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。處理0.5 h后，IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯升高，各處理組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）?？瞻捉M、對(duì)照組和各TNF-α處理組IL-1β mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,見表 4。

表2 細(xì)胞分化過程中ADPNmRNA、PPAR-γmRNA的表達(dá)（n=3s）

表2 細(xì)胞分化過程中ADPNmRNA、PPAR-γmRNA的表達(dá)（n=3s）

觹觹P ＜ 0．01；表 3、4 同

組別第0天（1）第2天（2）第4天（3）第6天（4）第8天（5）F P 1∶2 1∶3 1∶4 1∶5 3∶4 4∶5 ADPN mRNA 1.000 0±0.000 0 3.603 7±0.272 5 11.921 7±0.501 8 109.020 7±1.777 4 2 167.803 3±13.337 0 75 667.792**0.010 0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 PPAR-γ mRNA 1.000 0±0.000 0 4.171 3±0.173 6 3.356 7±0.337 2 6.146 7±0.710 9 6.821 7±0.205 6 116.941**0.001 0.010 0.001<0.001 0.008 0.095

3 討論

肥胖可增加脂肪組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性因子（如TNF-α、IL-6）基因的大量表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致外周組織，包括脂肪組織本身，產(chǎn)生IR，導(dǎo)致T2DM的發(fā)生。目前已證實(shí)過量的TNF-α可作為炎性介質(zhì)引起炎癥反應(yīng)，參與疾病的發(fā)生[1]。

PPAR-γ是ADPN最主要的轉(zhuǎn)錄因子。本研究表明3T3-L1脂肪細(xì)胞分化過程中ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步證明了脂肪細(xì)胞的確是活躍的內(nèi)分泌細(xì)胞[3]，說明隨著脂肪細(xì)胞的成熟，PPAR-γ活性可能逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致ADPN mRNA的表達(dá)隨脂肪細(xì)胞分化成熟而增加，此點(diǎn)與Maeda等[4]的發(fā)現(xiàn)一致。

表3 TNF-α對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞ADPN mRNA、PPAR-γ mRNA 表達(dá)的影響 （n=3s）

表3 TNF-α對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞ADPN mRNA、PPAR-γ mRNA 表達(dá)的影響 （n=3s）

組別空白組（1）對(duì)照組（2）0.5 h 組（3）4 h 組（4）8 h 組（5）24 h 組（6）F P 2∶3 2∶4 2∶5 2∶6 3∶4 4∶5 5∶6 ADPN mRNA 1.000 0±0.000 0 2.214 3±0.051 3 1.358 3±0.049 0 0.650 7±0.071 0 0.459 0±0.036 9 0.524 3±0.075 1 471.792**<0.001 0.001<0.001 0.001 0.004 0.005 0.062 PPAR-γ mRNA 1.000 0±0.000 0 1.394 0±0.049 9 1.159 0±0.043 3 0.166 0±0.017 1 0.228 0±0.023 5 0.188 7±0.040 8 811.664**0.061<0.001<0.001<0.001<0.001 0.002 0.054

表4 TNF-α對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 及 IL-1β mRNA 表達(dá)的影響 （n=3s）

表4 TNF-α對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞TNF-α mRNA、IL-6 mRNA 及 IL-1β mRNA 表達(dá)的影響 （n=3s）

組別空白組（1）對(duì)照組（2）0.5 h 組（3）4 h 組（4）8 h 組（5）24 h 組（6）F P 2∶3 2∶4 2∶5 2∶6 3∶4 4∶5 4∶6 5∶6 TNF-α mRNA 1.000 0±0.000 0 1.004 0±0.119 0 42.378 7±3.456 3 113.778 3±21.288 5 31.842 7±2.640 0 25.879 7±3.221 9 64.069**0.002 0.005 0.003 0.003 0.009 0.008 0.009 0.186 IL-6 mRNA 1.000 0±0.000 0 3.189 0±0.067 8 59.523 0±7.861 0 43.206 3±2.124 1 26.884 7±1.874 7 62.080 3±9.940 2 76.909**0.007 0.001 0.001 0.002 0.092 0.006 0.034 0.004 IL-1β mRNA 1.000 0±0.000 0 2.715 7±0.465 7 1.630 3±1.158 3 3.913 7±1.804 9 1.928 7±1.568 5 2.767 0±1.762 2 1.826--------

本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的TNF-α對(duì)ADPN mRNA和PPAR-γ mRNA的表達(dá)有明顯的時(shí)間依賴性抑制作用。ADPN是一種由脂肪細(xì)胞分泌的特異性脂源性膠原樣蛋白，可通過降低組織中三酰甘油濃度，增強(qiáng)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）途徑，下調(diào)糖異生的關(guān)鍵酶，抑制TNF-α的分泌等增強(qiáng)胰島素敏感性，從而改善IR。PPAR-γ除了通過ADPN影響IR外，它的激活還可促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1、GLUT2、GLUT4的表達(dá),并導(dǎo)致糖、脂代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一些關(guān)鍵基因表達(dá)的改變[5]。因此，TNF-α對(duì) ADPN和PPAR-γ的抑制作用直接影響機(jī)體IR。

本研究中以高濃度TNF-α處理成熟脂肪細(xì)胞后，TNF-α mRNA的表達(dá)開始明顯增加，4 h達(dá)峰值后下降，說明TNF-α可明顯增加其自身的表達(dá)。過度表達(dá)的TNF-α可能通過以下機(jī)制引起IR：（1）減少IRS-1的酪氨酸磷酸化，抑制胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。（2）促進(jìn)脂肪分解，增加游離脂肪酸，間接影響胰島素敏感性。（3）下調(diào)脂肪細(xì)胞中多種重要的信號(hào)分子或蛋白表達(dá)，導(dǎo)致IR[5]。（4）影響轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ的活性，進(jìn)而影響脂聯(lián)素等靶基因的表達(dá)[6]。（5）TNF-α可直接導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的凋亡[7]。因此，本研究進(jìn)一步證明了TNF-α是引起IR的重要炎癥因子。IL-6是一種多效能的細(xì)胞炎癥因子。本研究顯示TNF-α可促使炎癥因子IL-6 mRNA的表達(dá)水平升高，說明TNF-α可誘發(fā)脂肪細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)某些炎癥因子的合成與分泌，從而進(jìn)一步加重肥胖患者的慢性炎癥水平，進(jìn)而導(dǎo)致或加重胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α使IL-1β mRNA的表達(dá)有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也與IL-1β mRNA在T2DM的大量表達(dá)可能主要是高糖原因的研究觀點(diǎn)相吻合[8]。

由此可見，TNF-α在T2DM發(fā)病的炎癥機(jī)制和肥胖-炎癥-IR-T2DM的病理生理過程中起著重要作用。TNF-α在脂肪組織或細(xì)胞中的過度表達(dá)與IR的發(fā)生有密切關(guān)系。需要指出的是，腹內(nèi)脂肪積聚被認(rèn)為是肥胖導(dǎo)致IR的重要環(huán)節(jié)，即使體質(zhì)量不增加只要腹內(nèi)脂肪增加也會(huì)發(fā)生IR，這可能與腹內(nèi)脂肪組織的局部缺氧有關(guān)[9]。因此，對(duì)肥胖（尤其是腹型肥胖）的防治和對(duì)于肥胖后慢性炎癥反應(yīng)的干預(yù)，在臨床治療IR中有著重要的意義。

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