楊榮華，任京東，屈云霞

（泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271016）

銀杏葉提取物化學(xué)成分復(fù)雜，主要活性成分為黃酮類化合物及萜類內(nèi)酯。目前國際上公認的銀杏葉制劑的含量標準為黃酮類化合物≥24%，銀杏內(nèi)酯≥6%[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃酮苷能有效地清除體內(nèi)有毒過氧自由基的作用，具有降低血脂、促進血液循環(huán)及腦代謝功能；銀杏萜類內(nèi)酯除了具有擴張冠狀動脈血管、增加血流量、改善腦營養(yǎng)和抗菌作用外，還具有較強的血小板活化因子抑制作用，因此具有較高的藥用和經(jīng)濟價值[2]。

銀杏葉中有效成分的提取常用的方法為有機溶劑浸取法、水浸取法、超臨界流體萃取法、高速逆流色譜技術(shù)提取法、細胞組織培養(yǎng)合成法、樹脂吸附法、酶提取法等[3]。各種方法均有其特點，但存在提取時間長、效率低、溶劑用量大或設(shè)備復(fù)雜、成本高等缺點，而超聲波提取具有設(shè)備簡單、提取方便、效率高、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于植物有效成分的提取[4]。本研究利用超聲波對銀杏葉中黃酮類化合物進行提取，用分光光度法測定總黃酮的含量，并對提取條件進行了單因素和正交試驗分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（日本島津）；KS-80高速萬能粉碎機；R-201恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）；DHG-9076A電熱鼓風干燥箱；回流冷凝裝置；PHS-3C型精密pH計（上海第三分析儀器廠）。

1.2 試藥

蘆丁對照品（批號：200915347，中國藥品生物制品檢驗所）；銀杏葉（取自泰安岱廟內(nèi)銀杏樹，九月采集新葉，經(jīng)清洗、干燥后粉碎成粗粉，經(jīng)鑒定為銀杏葉）；無水乙醇（分析純，天津化工廠）；氫氧化鈉（化學(xué)純固體，上?；瘜W(xué)試劑公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液制備

2.2.1 常規(guī)溶劑提取法 取10 g銀杏葉于回流冷凝裝置中，用70%乙醇溶液作為提取溶劑，在提取溫度70℃、固液比為1∶20、提取劑pH值為8的條件下回流提取4 h[5]。將提取液濃縮并定容，得到樣品溶液。

2.2.2 超聲波提取法 取10 g銀杏葉放入回流冷凝裝置中，加入一定濃度的乙醇溶液做溶劑，然后將實驗裝置放入超聲設(shè)備中，在一定條件下進行正交試驗，超聲提取銀杏葉中黃酮類化合物，將提取液過濾、濃縮后定容，得到樣品溶液。

2.2 標準曲線的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品10.00 mg，以30%乙醇定容到50 ml量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/ml的標準液。 分別移取上述蘆丁標準液0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0 ml于6只25 ml量瓶中，用30%乙醇補充至12.5 ml，加入1 mol/L氫氧化鈉5 ml，用30%乙醇稀釋至刻度，10 min后于330 nm處測定吸光度A，以試劑作為空白參比。測得不同質(zhì)量濃度下各標準溶液吸光度值，用最小二乘法作線性回歸，得到蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系曲線的回歸方程[6-7]：

式中，ρ：黃酮質(zhì)量濃度（mg/ml）；相關(guān)系數(shù) r=0.9996。

2.3 不同樣品總黃酮濃度及提取率測定

移取提取液1 ml，置于25 ml量瓶中，按照上述操作加試劑后，過濾，在330 nm處測出各樣品的吸光度，代入標準曲線求出所含黃酮的質(zhì)量濃度。分別按以下公式求出銀杏葉中總黃酮類化合物的提取率：

式中，V：提取液的體積，單位為ml；P：提取液含黃酮的質(zhì)量濃度，單位為mg/ml；m1：銀杏葉的質(zhì)量，單位為mg。

2.4 提取溶劑及濃度的確定

常用的銀杏葉提取溶劑主要有水、甲醇、乙醇、丙酮等，由于甲醇、丙酮溶劑毒性較大，而水的提取率較低，故選用乙醇作為提取溶劑。稱取10 g干燥并粉碎的銀杏葉，在超聲功率為80%、超聲時間30 min、溶劑用量為銀杏葉量12倍的條件下， 當乙醇濃度為 0、20%、30%、40%、50%、60%、70%時超聲提取1次，將得到的提取液定容，移取一定量的試樣測量總黃酮的提取率。結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對黃酮類化合物的提取率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

由圖1可知，提取率隨乙醇濃度增加而增加，雖然高濃度乙醇作為溶劑可得到更好的提取率，但考慮到成本亦將隨之大幅度提高，而且用30%乙醇提取率已經(jīng)達到0.9%以上，再提高乙醇濃度提取率增加幅度較小，所以本實驗選擇30%乙醇作為提取溶劑。

2.5 超聲波功率對提取率的影響

超聲提取過程中，超聲波功率大小是影響最終黃酮含量的重要因素。稱取10 g干燥并粉碎的銀杏葉，在超聲時間30 min、乙醇濃度30%、溶劑用量為銀杏葉量12倍的條件下超聲提取1次，考察超聲功率對總黃酮提取率的影響。見圖2。

圖2 超聲波功率對黃酮類化合物的提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic power on the extraction rate of flavonoids

由圖2可知，提取率隨超聲波功率的增加而增加，當達到90%以上時效果最好，由于所用超聲波器功率較低，故采用100%效果更好。

2.6 超聲時間對提取率的影響

稱取10 g干燥并粉碎的銀杏葉，在超聲功率為80%、乙醇濃度為30%、溶劑用量為銀杏葉量12倍的條件下超聲提取 1 次，每次選取時間為 15、30、45、60、75、90 min 的條件，考察超聲時間對銀杏葉中總黃酮提取率的影響。結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時間對黃酮類化合物的提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids

由圖3可知，提取率隨超聲時間的增加而增加，當超聲時間達45 min時提取率已達0.96%以上，45 min以后增加幅度明顯降低。

2.7 溶劑用量對提取率的影響

稱取10 g干燥并粉碎的銀杏葉，在超聲功率為80%、超聲時間30 min、乙醇濃度為30%的條件下，選取m（乙醇）∶m（銀杏葉）=6、8、10、12、14、16、18 的條件，考察溶劑用量對銀杏葉中總黃酮提取率的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 溶劑用量對黃酮類化合物的提取率的影響Fig.4 The effect of consumption of solvent on the extraction rate of flavonoids

由圖4可知，提取率隨乙醇用量的增加而增加，在乙醇用量為銀杏葉量的12倍時總黃酮的提取率達到較高水平，再增加溶劑用量提取率增幅較小。

2.8 最佳提取條件的確定

在超聲條件下提取銀杏葉中黃酮類化合物，影響提取率的因素很多，為確定最佳提取條件，以總黃酮的提取率和含量為測定指標，在乙醇濃度為30%條件下，設(shè)計四因素三水平正交試驗，考察超聲功率、超聲時間、溶劑用量和提取次數(shù)對銀杏黃酮提取率的影響。實驗因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Levels of the factors in orthogonal tests

依據(jù)上述因素和水平設(shè)計正交實驗L9（34），進行提取實驗，測量提取液中總黃酮的提取率。結(jié)果見表2。

對實驗結(jié)果進行極差分析，根據(jù)極差大小判斷各因素的影響。結(jié)果表明，四個因素中對總黃酮提取率影響的大小次序：提取次數(shù)＞超聲波功率＞溶劑用量＞超聲時間，即用30%的乙醇作為提取劑，超聲功率為100%、超聲時間為45 min、溶劑用量為銀杏葉用量的12倍、提取次數(shù)為2次。在此條件下提取銀杏葉中黃酮類化合物，總黃酮的提取率可達1.20%。

表2 正交試驗結(jié)果分析表Tab.2 The results analysis of the orthogonal tests

比較兩種方法發(fā)現(xiàn)，常規(guī)溶劑提取銀杏葉的方法，無論是溶劑濃度、提取時間，還是溶劑用量均要求較高，且提取率、含量均較低，說明采用超聲法提取銀杏葉，可以大量節(jié)省時間，降低成本，且能夠得到較高的提取率，充分體現(xiàn)了超聲法提取銀杏葉的優(yōu)點：省時、省溶劑、高效率。

3 討論

通過實驗表明，在超聲波條件下用乙醇作為溶劑提取銀杏葉中有效成分的最佳工藝條件為：超聲功率100%、超聲時間45 min、溶劑濃度30%、溶劑用量為銀杏葉用量的12倍，在此條件下提取2次，銀杏葉中黃酮類化合物的提取率可達到1.20%以上。與傳統(tǒng)的溶劑法相比，溶劑濃度、固液比、提取時間大大降低，而提取率顯著提高，提取率是常規(guī)溶劑法提取率的1.5倍以上。因此，超聲波用于銀杏葉提取具有成本低、時間短、回收率高、有機溶劑殘留少等優(yōu)點。

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