高志新 郝保同 劉寶林 王 欣 周國(guó)艷
與平衡凍結(jié)過(guò)程相比,過(guò)冷度大的溶液往往形成尖細(xì)的樹(shù)枝狀晶體,細(xì)胞和細(xì)胞間隙組織更容易受到這種針尖狀晶體的機(jī)械損傷[1]。因此,通過(guò)提高低溫保護(hù)劑溶液的成核溫度,有效的降低溶液的過(guò)冷度,對(duì)細(xì)胞和組織的成功保存是非常重要的。
羥基磷灰石納米微粒由于具有極強(qiáng)的親水性表面和較小的體積,易在水溶液中懸浮,而且對(duì)細(xì)胞和生物組織沒(méi)有毒性,可誘發(fā)保護(hù)劑凍結(jié)過(guò)程的異相成核,提高過(guò)冷度。已有文獻(xiàn)證明了納米微粒在常溫狀態(tài)下可以增強(qiáng)流體的導(dǎo)熱系數(shù)[2]、傳熱效率[3]以及臨界熱流量[4]等。正是由于納米微粒在常溫狀態(tài)下表現(xiàn)的優(yōu)良特性,有些學(xué)者嘗試將納米微粒引入低溫生物學(xué)領(lǐng)域。Han[5]等將納米微粒加入到低溫保護(hù)劑中,發(fā)現(xiàn)納米微粒能提高溶液相變點(diǎn)以上的導(dǎo)熱系數(shù)和降低溶液的反玻璃化溫度,并從納米微粒顯著促進(jìn)冰晶的成核過(guò)程做了初步解釋。但是納米微粒在相變點(diǎn)溫度以下,能顯著的增加溶液的粘度,影響低溫保護(hù)劑的分子結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響了納米低溫保護(hù)劑的在降溫過(guò)程中的凍結(jié)特性,關(guān)于這方面的研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用DSC研究了HA納米微粒對(duì)乙二醇溶液降溫過(guò)程的凍結(jié)參數(shù),為進(jìn)一步完善低溫保護(hù)劑的配置和細(xì)胞的成功保存提供了理論與方法支持。
乙二醇(威爾昆化學(xué)試劑有限公司)為實(shí)驗(yàn)用分析純?cè)噭兌龋?9.8%。羥基磷灰石(HA)納米微粒純度為99.99%,形狀為半球形或者球形(南京埃普瑞納米材料有限公司)。溶液配制和儀器標(biāo)定均采用二次蒸餾水。標(biāo)定用的環(huán)戊烷(上海生化試劑公司)為色譜標(biāo)準(zhǔn)試劑,標(biāo)定用水和溶液配制用水均為本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的二次蒸餾水。乙二醇在使用前用CaH2處理并經(jīng)減壓蒸餾。二次蒸餾水使用前用0.2 um微孔濾紙過(guò)濾。
本實(shí)驗(yàn)用差示掃描量熱儀為DSC-Pyris Diamond(美國(guó)Perkin-Elmer公司)。溫度標(biāo)定采用環(huán)戊烷的晶-晶轉(zhuǎn)變點(diǎn)(外推起始溫度為-135.06℃)和二次蒸餾水的熔融溫度0℃(均采用外推起始溫度)進(jìn)行兩點(diǎn)標(biāo)定[6]。液氮冷卻采用CryofillTM,Perkin-Elmer公司的液氮容器控制。樣品沖洗氣體為高純度氦氣(純度 > 99.999%),流量30 mL/min保持不變。樣品皿為標(biāo)準(zhǔn)液體鋁皿(美國(guó)Perkin-Elmer公司),樣品量為 5 mg—15 mg,精確到 ±0.01 mg。天平采用賽多利斯的BP211D,精確到0.01 mg。
溶液均以質(zhì)量濃度配置。乙二醇溶液的濃度分別為 0,1%,5%,15%20%,30%,40%。羥基磷灰石納米微粒的質(zhì)量濃度分別為0.05%,0.1%,和0.2%,粒徑分別為20 nm,40 nm,60 nm。納米微粒加入乙二醇溶液后采用細(xì)胞超聲震蕩粉碎儀震蕩,定時(shí)90分鐘,超聲功率為350 kW。樣品皿采用標(biāo)準(zhǔn)液體鋁皿,并用液固通用壓機(jī)(美國(guó))壓制密封。每一個(gè)樣品都必須按照相同升降溫程序?qū)悠访?、?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)皿和空皿進(jìn)行掃描,然后再進(jìn)行下一個(gè)樣品。為消除試樣的熱歷史,加樣后首先將試樣以150℃/min快速升溫到所需溫度區(qū)間的上限,然后以150℃/min快速降溫到所需溫度區(qū)間的下限。如此重復(fù)2—3次,調(diào)至實(shí)驗(yàn)起始溫度,恒溫3 min—5 min,然后以相同的降溫和升溫速率掃描并記錄熱流數(shù)據(jù),掃描速率為10℃/min。待熱流穩(wěn)定后開(kāi)始采集數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品作3個(gè)平行樣,實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值。
轉(zhuǎn)變溫度采用熱分析軟件Pyris Software(美國(guó)Perkin-Elmer公司,5.0版本)讀取。在相變前后比熱變化不大時(shí),用標(biāo)準(zhǔn)基線,變化較大時(shí)使用“S”形基線。成核溫度取臺(tái)階上升沿斜率最大點(diǎn)和基線交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的溫度即外推起始溫度。熔融溫度取熔融峰頂點(diǎn)溫度(peak)[7]。如圖1所示為40%乙二醇溶液降溫和復(fù)溫DSC熱流曲線。為方便起見(jiàn),在取實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí),將每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的6組數(shù)據(jù)舍棄最大值和最小值,取4個(gè)數(shù)據(jù)的平均值作為分析的依據(jù)。
圖1 0.1%HA納米微粒+15%EG溶液降溫曲線Fig.1 DSC cooling thermograms of 0.1%HA nanoparticles and 15%EG solution
基于冰晶的成核理論[1],在結(jié)晶過(guò)程中,母相中產(chǎn)生穩(wěn)定的新相核的過(guò)程稱為成核過(guò)程。根據(jù)成核機(jī)理的不同分為均相成核和異相成核。均相成核過(guò)程是由于液相內(nèi)的能量和密度的隨機(jī)起伏漲落,系統(tǒng)內(nèi)的分子不時(shí)的聚集成團(tuán)而自發(fā)的成核過(guò)程。與均相成核相比異相成核更常見(jiàn),異相成核是由于溶液中參雜了外來(lái)的雜質(zhì)顆粒或者接觸已有的界面如容器壁面等,這些不純物質(zhì)和界面起到了晶種的作用。這樣的成核過(guò)程為異相成核。因此本實(shí)驗(yàn)所說(shuō)的成核溫度指的是異相成核溫度。
不同濃度的溶液其平衡凍結(jié)點(diǎn)是不同的,降溫時(shí),溶液只有先過(guò)冷到其平衡凍結(jié)點(diǎn)以下的某個(gè)溫度,溶液中的水才開(kāi)始凍結(jié)。溶液的平衡凍結(jié)點(diǎn)與成核溫度之差稱為溶液凍結(jié)的過(guò)冷度[8]。
由圖2可知加入HA納米微粒的乙二醇溶液與純乙二醇溶液相比較,在一定的濃度范圍內(nèi),降溫或升溫過(guò)程所表現(xiàn)的相行為有許多相似之處。在降溫過(guò)程中,溶液均要先過(guò)冷到某一溫度才開(kāi)始凍結(jié),且凍結(jié)溫度隨著溶液濃度的增加而降低,原因是乙二醇分子與水分子之間有較強(qiáng)的氫鍵作用,這些氫鍵的存在降低了形成冰晶所需要的相變驅(qū)動(dòng)力[9]。同結(jié)晶過(guò)程相比較,熔融過(guò)程在較寬的范圍內(nèi)完成的。在質(zhì)量濃度低于20%時(shí),加入納米微粒后溶液成核溫度變化不明顯,但是當(dāng)溶液濃度高于20%時(shí),加入納米微粒能顯著的提高溶液的成核溫度??赡艿脑蚴?,當(dāng)溶液的濃度與納米微粒的加入量均較小時(shí),此時(shí)溶液中水分子占據(jù)主導(dǎo)作用,因此溶液的成核特性更多的表現(xiàn)為純水的凍結(jié)特性。納米微粒,乙二醇分子及水分子之間的相互作用還不足以對(duì)溶液的凍結(jié)過(guò)程產(chǎn)生較大的影響。溶液凍結(jié)的隨機(jī)性比較大。但是隨著溶液濃度的增加,溶質(zhì)-溶劑之間的相互作用開(kāi)始對(duì)溶解過(guò)程產(chǎn)生明顯的影響,主要表現(xiàn)在大大降低了溶液凍結(jié)的隨機(jī)性。
圖2 不同濃度的乙二醇溶液成核溫度Fig.2 Nucleation temperature of different concentrations of EG solution
由表1可知對(duì)40%的乙二醇溶液加入不同粒徑和不同質(zhì)量濃度的HA納米微粒,溶液的成核溫度與過(guò)冷度均顯著的降低。加入HA納米微粒的粒徑越大或者質(zhì)量濃度越大,溶液過(guò)冷度降低的越顯著。
表1 用DSC測(cè)得加入HA納米微粒的乙二醇溶液的成核溫度和熔融溫度Table 1 Nucleation temperature and melting temperature of different concentrations of EG solution measured by DSC
將HA納米微粒加入乙二醇溶液中,HA納米微粒便起到了成核基體的作用,在異相成核過(guò)程中成核界面是已經(jīng)存在的,晶體的生長(zhǎng)是由低能量的晶核和成核基體取代原先的界面,這種界面取代比界面產(chǎn)生所需能量小。即其成核勢(shì)壘小,所以異相成核將在比較小的過(guò)冷度下發(fā)生。在低濃度區(qū)間溶液的凍結(jié)隨機(jī)性較大,但是在中高濃度區(qū)間,由于溶液內(nèi)各組分之間的相互作用,有效的抑制了這種隨機(jī)性,溶液的凍結(jié)表現(xiàn)出較強(qiáng)的規(guī)律性。但是溶液的微觀結(jié)構(gòu)與溶液的宏觀性質(zhì)-過(guò)冷度到底存在一個(gè)什么樣的定量關(guān)系,單純的依靠DSC是很難做出解釋的。依靠異相成核的機(jī)理,定性的分析了HA納米微粒加入乙二醇溶液后的成核現(xiàn)象以及對(duì)溶液過(guò)冷度的影響。
圖3所示為異相成核示意圖。將HA納米微??闯砂霃綖镽n的成核基體,晶胚為半徑是r的球冠,θ為其接觸角。異相成核時(shí)的臨界晶核半徑r*和臨界成核勢(shì)壘ΔG*
其中:
式中:σ12是納米粒子與流體之間的比表面自由能;σ23是晶核與納米粒子之間的比表面自由能;σ12是晶核與流體之間的比表面自由能。
圖3 異相成核示意圖
圖4給出了f(η,x)隨x的變化情況,由圖可見(jiàn)隨x增大,f(η,x)是減小的,這時(shí)ΔG*也減小,這表明當(dāng)Rn增大時(shí)溶液容易成核,與實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果相同。同時(shí)由于-1≤η≤1,對(duì)相同的x,η越大成核勢(shì)壘越小,較大的η也反映了濕潤(rùn)程度大,這時(shí)雜質(zhì)基體與晶體之間的界面能σ23較小,故而利于成核。HA納米微粒具有較大的面積與體積比,和極強(qiáng)的親水性,即晶胚與納米微粒的濕潤(rùn)程度較大,更加有利于冰晶的成核。
利用差熱掃描熱儀(DSC)研究了HA納米微粒對(duì)乙二醇溶液的成核溫度和過(guò)冷度的影響。證明納米微粒能顯著的促進(jìn)晶核的形成和降低溶液的過(guò)冷度。并通過(guò)異相成核簡(jiǎn)要分析了納米微粒對(duì)保護(hù)劑溶液的作用機(jī)理。深入的分析納米低溫保護(hù)劑在降溫、復(fù)溫過(guò)程中產(chǎn)生的一系列熱力學(xué)變化以及納米微粒與溶液分子間的相互作用,為改進(jìn)生物材料的低溫保存和研究納米微粒在低溫領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
圖4 f(η,x)隨x的變化Fig.4 Relationship between f(η,x)with changes of x
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