吳志明，陳江，儲修峰，婁建平，孟興成，邱海江

清營瀉瘀方對腸缺血再灌注損傷大鼠腸屏障的保護作用

吳志明，陳江，儲修峰，婁建平，孟興成，邱海江

目的：探討清營瀉瘀方對腸缺血再灌注損傷大鼠腸屏障的保護作用及可能機制。方法：80只SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組（n＝8）、腸缺血再灌注模型組（n＝24）、清營瀉瘀方治療組（n＝24）和大承氣方治療組（n＝24），后3組按造模后處死時間的不同又分別分為術(shù)后2 h組、術(shù)后24 h組和術(shù)后48 h組，每組8只。采用夾閉腸系膜上動脈45 min的方法誘導腸缺血再灌注損傷模型，分別觀察再灌注后2 h、24 h和48 h腸黏膜的病理改變以及血清中TNF-α、IL-10和血漿中D-乳酸的水平。結(jié)果：清營瀉瘀方和大承氣方都能夠減輕腸黏膜的損傷，降低血中TNF-α和D-乳酸的含量（P<0.05），晚期降低IL-10水平（P<0.05）。清營瀉瘀方在在保護腸黏膜和降低血D-乳酸的水平方面優(yōu)于大承氣方（P<0.05）。結(jié)論：清營瀉瘀方對腸缺血再灌注損傷大鼠腸屏障有顯著的保護作用，其可能機制與蕩滌腸胃宿垢，減少細菌移位、調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)平衡有關(guān)。

腸缺血再灌注；清營瀉瘀方；大承氣方；腸屏障功能

目前研究表明，腸缺血再灌注損傷是嚴重創(chuàng)傷、休克和感染的發(fā)生中常見的病理生理過程，從而引起腸黏膜屏障損害，造成腸道細菌、內(nèi)毒素移位，引起網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)生系列反應，釋放大量細胞因子和其它炎癥介質(zhì)，導致失控的炎癥反應和膿毒癥，是導致多器官功能障礙綜合征（MODS）形成的主要原因。因此在防治創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS發(fā)生發(fā)展中，如何減輕腸缺血再灌注損傷，已經(jīng)引起了國內(nèi)外學者的普遍關(guān)注。

我們在臨床實踐發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注損傷急性期以熱邪和毒邪為主，表現(xiàn)為熱毒熾盛,采用清營瀉瘀方，清熱解毒，涼血瀉瘀，臨床應用效果顯著。本實驗通過建立大鼠腸道缺血再灌注模型，研究腸道缺血再灌注損傷對腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的影響,并與大承氣方對比，研究清營瀉瘀方對腸缺血再灌注大鼠腸屏障的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物SD雄性大鼠80只，體重（280±10）g，清潔級，浙江大學醫(yī)學院實驗動物公司提供，清潔級動物房飼養(yǎng)，20～24℃，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。1.2藥物戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司。中藥清營瀉淤方：水牛角片30 g，益母草30 g，生大黃15 g（后下），芒硝12 g，黨參15 g，甘草10 g；中藥大承氣方：生大黃12 g（后下），厚樸24 g，枳實12 g，芒硝6 g（沖）；采用配方顆粒制成濃度為1∶1藥液(含生藥1 g/mL),滅菌處理后4℃冰箱內(nèi)保存。配方顆粒劑由江蘇天陰藥業(yè)有限公司提供（批號：0809168）。

1.3 主要試劑及儀器TNF-α和IL-10的試劑盒分由美國Biosouce International Inc和R＆D Systems Inc公司提供。D－乳酸試劑盒為美國Synthecon公司產(chǎn)品，D-乳酸脫氫酶(D-LDH)購于美國Sigma公司。芬蘭Labsystems Dragon Wellscan MK2型酶標儀。

1.4 動物模型的制備用1%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，于上腹部正中切口（長約2 cm）入腹，分離腸系膜上動脈及其周圍組織，在腸系膜上動脈根部用動脈夾鉗夾，觀察2 min。待確定腸系膜上動脈血流被阻斷后（腸壁蒼白，血管無搏動）縫合傷口，45 min后開腹，打開動脈夾，恢復腸系膜上動脈血液供應（腸壁變紅，血管搏動），再關(guān)腹。整個手術(shù)過程中，于腹腔內(nèi)滴加37℃生理鹽水5 mL，保持血流動力學的穩(wěn)定，并注意給大鼠保暖。

1.5 動物分組及給藥方法將80只大鼠隨機分為假手術(shù)組（8只）、模型組（24只）、清營瀉瘀方治療組即清瀉組（24只）和大承氣方治療組即承氣組（24只），后3組按造模后處死時間的不同又分別分為再灌注后2 h組、再灌注后24 h組和再灌注后48 h組（每組8只）。各組大鼠術(shù)前2 d，分別給予生理鹽水、清營瀉瘀方和大承氣方灌胃（2.2 mL/只/d），最后一天灌胃在術(shù)前30 min。按組別分于再灌注后2 h、24 h和48 h處死動物，取末端回腸組織作病理切片，所采血樣3 000 r，離心20 min，分離血清和血漿，置-70℃超低溫冰箱中保存。

1.6 檢測指標及其方法組織病理學:將回腸末端組織固定于中性福爾馬林溶液中,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片HE染色后光鏡下觀察組織學變化。血清中TNF-α和IL-10的測定：采用酶標儀進行測定，試驗嚴格按照試劑盒使用說明所規(guī)定的操作規(guī)程和結(jié)果判定方法進行。血漿D－乳酸的測定:血漿D-乳酸采用改良的酶學分光光度法檢測。將血漿加入試管,與含4.6 mmol/L NAD+的碳酸鹽緩沖液混合。待測管加入50 μL D-乳酸脫氫酶,空白管加入50 μL蒸餾水,以空白管調(diào)零于340 nm處測定吸光度[7]。

1.7 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腸黏膜組織形態(tài)學觀察腸黏膜病理采用Chiu評分，評分標準見表1，結(jié)果見表2。光鏡下，假手術(shù)組回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯變化；模型組腸I/R后2 h后呈急性炎癥改變：黏膜和黏膜下層充血、水腫和糜爛，固有層有多量中性粒細胞浸潤，部分可見黏膜上皮壞死脫落（圖1）；清瀉組和承氣組亦可見上述表現(xiàn)，但損傷程度較模型組明顯減輕（P< 0.01），清瀉組優(yōu)于承氣組（P<0.05）（圖2～圖3）；腸I/R后24 h和48 h，各組腸黏膜結(jié)構(gòu)基本修復，治療組與模型組無明顯差別,但同假手術(shù)組比較均有顯著性差別（P<0.01）。

表1 腸黏膜損傷評分標準

表2 各組間大鼠腸黏膜Chiu評分±SD)

表2 各組間大鼠腸黏膜Chiu評分±SD)

注：與模型組相比較，**P<0.01；與承氣組比較,◇P<0.05

組別假手術(shù)組模型組清瀉組承氣組n8 8 8 8再灌注2 h 0.63±0.52**4.13±0.83 2.38±0.52**◇3.13±0.64**再灌注24 h 0.63±0.52**2.13±0.64 1.75±0.71 1.88±0.64再灌注48 h 0.63±0.52**2.00±0.76 1.50±0.53 1.75±0.46

圖1 模型組腸I/R后2 h（HE,×40）

圖2 清瀉組腸I/R后2 h（HE,×40）

圖3 承氣組腸I/R后2 h（HE,×40）

2.2 血清中TNF-α和IL-10含量的變化腸I/R后2 h，與假手術(shù)組相比，模型組血清中TNF-α水平明顯升高，有顯著性差別；清瀉組和承氣組TNF-α水平均較模型組均明顯降低，差別有顯著性；但IL-10的表達在各組間無差別。腸I/R后24 h，與假手術(shù)組相比，模型組血清中TNF-α和IL-10水平均明顯升高，有顯著性差別；清瀉組TNF-α水平較模型組降低，差別有統(tǒng)計學意義；清瀉組和承氣組IL-10水平均較模型組明顯降低，具有顯著性差別。腸I/R后 48 h，治療組與模型組無明顯差別,但同假手術(shù)組比較均有顯著性差別。見表3～表4。

表3 各組間大鼠血清TNF-α含量的比較±SD:pg/mL）

表3 各組間大鼠血清TNF-α含量的比較±SD:pg/mL）

注：與模型組相比較，**P<0.01；與承氣組比較,◇P<0.05

組別假手術(shù)組模型組清瀉組承氣組n8 8 8 8再灌注2 h 90.77±4.41**143.21±18.19 104.17±6.40**107.10±11.82**再灌注24 h 90.77±4.41**114.88±13.73 102.83±13.90◇104.94±9.32再灌注48 h 90.77±4.41**110.50±7.64 105.08±6.88 105.69±6.56

表4 各組間大鼠血清IL-10含量含量的比較±SD:pg/mL）

表4 各組間大鼠血清IL-10含量含量的比較±SD:pg/mL）

注：與模型組相比較，*P<0.05，**P<0.01

組別假手術(shù)組模型組清瀉組承氣組n8 8 8 8再灌注2 h 16.14±4.22 19.93±6.40 17.35±2.89 17.39±3.44再灌注24 h 16.14±4.22** 49.04±13.17 22.83±8.31**27.90±13.22**再灌注48 h 16.14±4.22** 39.89±16.04 31.03±14.32 30.25±16.06

2.3 血漿中D－乳酸含量的變化D－乳酸是腸道細菌特有的代謝產(chǎn)物，進入機體后不參與代謝反應因此血漿中D－乳酸含量的變化可反映腸黏膜通透性的改變。腸I/R后2 h,與假手術(shù)組相比，模型組血漿中D－乳酸水平明顯升高，有顯著性差別；清瀉組和承氣組D－乳酸水平較模型組均明顯降低，差別有顯著性，清瀉組優(yōu)于承氣組；腸I/R后24 h，與假手術(shù)組相比，模型組血漿中D－乳酸水平明顯升高，有顯著性差別；清瀉組D－乳酸水平較模型組降低，差別有統(tǒng)計學意義；腸I/R后48 h，與假手術(shù)組相比，模型組血漿中D－乳酸水平依然明顯升高，有顯著性差別；清瀉組和承氣組D－乳酸水平較均模型組降低，差別有統(tǒng)計學意義，清瀉組優(yōu)于承氣組。見表5。

表5 各組間大鼠血漿中D乳酸含量的比較±SD:mg/L）

表5 各組間大鼠血漿中D乳酸含量的比較±SD:mg/L）

注：與模型組相比較，*P<0.05,**P<0.01；與承氣組比較,◇P<0.05

組別假手術(shù)組模型組清瀉組承氣組n8 8 8 8再灌注2 h 3.60±0.69** 14.13±2.09 10.38±1.41**◇11.95±1.37**再灌注24 h 3.60±0.69** 9.93±1.03 8.54±0.54*9.19±0.36再灌注48 h 3.60±0.69** 9.08±0.56 7.29±0.96**◇8.31±0.79*

3 討論

中醫(yī)認為，邪和瘀是諸血管病發(fā)生的主要原因，以邪為主因，由邪（致病因子）致瘀（血栓）繼而傷正（缺血或郁血）[1]。因此邪盛致生新瘀則病急，邪祛但留舊瘀則病緩。盡管臨床研究[2]發(fā)現(xiàn)活血化瘀類中藥如丹參具有改善腹腔臟器的血液循環(huán)，防止血栓形成的作用，但是僅適用于慢性缺血階段，如果不擇時機，不辨病邪的全程重用，反可使療效降低，病程延長。我們在臨床實踐發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注損傷急性期以熱邪和毒邪為主，表現(xiàn)為熱毒熾盛，灼傷營血而生瘀，治療上以清熱解毒，涼血瀉瘀為主，療效顯著。

清營瀉瘀方是上海市名老中醫(yī)奚九一教授的臨床經(jīng)驗方劑，重用益母草、水牛角片作為清熱涼血解毒之主藥，具有清熱解毒、涼血行瘀、利水消腫的功效。此外根據(jù)“六腑以通為用”，“胃氣以降為順”的原則，還著重使用了通腑瀉下類藥物大黃和芒硝，蕩滌腸胃宿垢、致病菌和毒素，消除腸道麻痹造成的腸道瘀滯狀態(tài)，使病人在最短的時間內(nèi)排便、排氣，減少腸道有害物質(zhì)的吸收，減少腸道細菌移位；同時能夠通過調(diào)節(jié)前列腺素I2(PGI2)與血栓素B2(TXB2)之間的平衡，保證組織器官的微循環(huán)，改善腸道組織血液灌流，降低毛細血管的通透性，維護腸道黏膜屏障的正常功能，從而降低血中內(nèi)毒素水平，預防MODS的發(fā)生[3]。

TNF-α作為促炎介質(zhì)中的首動因子及致炎損傷網(wǎng)絡的中心環(huán)節(jié)，在腸缺血再灌注損傷中起著重要的作用，它可誘發(fā)IL-1、IL-6、IL-8、血小板活化因子（PAF）、前列腺素和白三烯等的分泌，由此產(chǎn)生炎癥連鎖反應，引起全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征。IL-10是一種有效的抗炎介質(zhì)，可拮抗TNF-α，產(chǎn)生保護作用，但產(chǎn)生過多可引起免疫抑制。清營瀉瘀方中益母草苦泄辛散，有利尿消腫，通暢水道的作用，使毒邪無以留置，大量的毒素及有害物質(zhì)從水道排出；水牛角味苦性寒，能入血分，有清熱解毒，涼血定驚之功，祛除熱邪；兩者合用拮抗炎性損傷，降低TNF-α和IL-10的表達，阻斷炎癥級聯(lián)反應，提高機體的免疫功能。

D-乳酸是腸道固有細菌的代謝終產(chǎn)物，由于其他哺乳動物機體各組織既不能產(chǎn)生D-乳酸也沒有快速代謝分解D-乳酸的酶系統(tǒng)，所以外周血D-乳酸主要來源于腸道，而其在肝內(nèi)不被分解，故其水平可反映腸道機械屏障的功能狀態(tài)。大多研究[4-5]表明，急性腸缺血引起的腸黏膜損傷可使血D-乳酸濃度迅速升高，并且D-乳酸含量與內(nèi)毒素濃度呈顯著正相關(guān)。清營瀉瘀方通過蕩滌腸胃宿垢、致病菌和毒素，降低炎癥介質(zhì)的含量而消除腸道瘀滯狀態(tài)，減少腸道有害物質(zhì)的吸收，減少腸道細菌移位，保護腸屏障功能，減少腸道細菌和內(nèi)毒素移位。

腸缺血再灌注損傷是多種因素參與的復雜病理過程，而目前單一的藥物治療往往無法奏效，所以只有全面考慮，盡可能地打斷多種環(huán)節(jié)的影響，才有可能取得突破性的進展。中藥清營瀉瘀方在臨床和動物實驗中顯示出較好的療效，但其應用方式、劑量、副作用及長期療效尚不肯定，缺乏嚴謹?shù)呐R床實驗設(shè)計及大樣本的對比研究，值得做進一步探討。我們應在臨床方面進行較大規(guī)模的前瞻、多中心研究，采用循證醫(yī)學的方法對其保護腸缺血再灌注方面的最終療效進行客觀的評價，并進一步研制開發(fā)出更為有效的藥物，從而為早期防治創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS的研究開辟新的途徑。

[1]奚九一．因邪致瘀，祛邪為先－論脈管病的診治思路與方法[J].上海中醫(yī)藥雜志，2001，35(6)：4.

[2]田伏州，尹致良，李小軍，等．丹參對腸道屏障的保護作用機制研究[J].中華消化雜志，2000，20（6）：409.

[3]趙衛(wèi)川，崔乃強，趙琪．承氣合劑缺血再灌流腸管內(nèi)毒素轉(zhuǎn)運的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，1998，4（2）：83.

[4]柳勒龍，田曉峰，張雪梅，等．D-乳酸在急性腸缺血早期診斷中的價值[J]．中華實驗外科雜志,2004,21（4）:497.

[5]吳彪,王春友.急性胰腺炎腸道屏障功能損傷時血漿內(nèi)毒素D-乳酸的變化[J].中華普通外科雜志,2009,18(3):224.

（收稿：2009-12-10修回：2010-06-20）

（責任編輯劉洪斌田在善）

Protective effect of Qing Ying Xie Yu Fang（清營瀉瘀方）on Gut Barrier Function on Intestine Isch?emia-Reperfusion Injury in Rats

Wu Zhiming,Chen Jiang,Chu Xiufeng,et al.Department of Surgery,Sha?

oxing County Central Hospital,Shaoxing(312030),China

ObjectiveTo study the effects and mechanism of Qing ying xie Yu Fang(QXF)（清營瀉瘀方）in the protection of gut barrier function of intestinal ischemia-reperfusion in rats.Methods Eighty Sprague Dawley rats were randomly divided into sham(n=8),model(n=24),QXF(n=24)and Da cheng Qi Fang(CQF)(大承氣方）(n=24)groups.The last three groups were respectively divided into 2 hour group,24 hour group and 48 hour group.Intestinal isxhemia-reperfusion model in rats was induced by clamping the superior mensenteric ar?tery for 45 minutes period.The pathologic injury of the intestine and the level of TNF-α,IL-10,D-lactic acid in blood were examined at 2 hour point,24 hour point and 48 hour point after reperfusion respectively.The sta?tistical analysis was finished with SPSS11.0 software.Results QXF and CQF both alleviated the pathologic in?jury of the intestine and reduced the levels of TNF-α,D-lactic acid(P,0.05)in the early period and IL-10(P< 0.05)in the late period.But QXF had better curative effects than CQF in reducing the level of D-lactic acid(P< 0.05).ConclusionQXF can reduce the gut injury of intestinal ischemia-reperfusion with the following possi?ble mechanism:to clear up dunghill in intestine,regulate the balance of inflammatory mediators and protect gut barrier function.

intestine ischemia-reperfusion inju?ry,Qing Ying Xie Yu Fang,Da Cheng Qi Fang,gut barrier function

Q95-33；R656.7

A

1007-6948(2010)05-0557-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2010.05.014

浙江省醫(yī)學會臨床科研基金項目（2009ZYC45）

浙江省紹興縣中心醫(yī)院(中國醫(yī)科大學紹興醫(yī)院）外科（紹興312030）

吳志明，Tel：0575-85580858；E-mail：wuzhimingmedi@tom.com