于 晶，周子珊，牟永潮，張永俠，蒼 晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

溫度是影響植物生長及分布的重要環(huán)境因子之一。植物在對低溫寒冷環(huán)境的長期適應(yīng)中通過自身的遺傳變異和自然選擇，形成了抵御寒冷的能力即抗寒性。研究植物抗寒性的方法很多，主要包括：田間自然鑒定法、室內(nèi)恢復(fù)生長法、電導(dǎo)法、鏡檢法、生理生化研究法、馬林契克法、低溫放熱分析法及分子生物學(xué)研究法等。其中，采用鏡檢法（即借助于顯微鏡直接觀察低溫后細(xì)胞內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化）研究植物的抗寒性的報道很多，如蘋果[1-2]、番荔枝[3]、唐古特紅景天[4]、桃葉珊瑚[5]、圓柏[6]、小麥[7]、梨[8]、柑桔[9]、桃[10]、云杉[11]、松樹[12]等，但上述報道多來自低溫較敏感或木本植物，由于抗寒性不同，所以它們細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化存在著一定差異。本試驗對強抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號和弱抗寒冬小麥品種濟麥22低溫脅迫下的葉片進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)的觀察，探討了冬小麥葉片結(jié)構(gòu)特征與其抗寒性的相關(guān)性，旨在為冬小麥生產(chǎn)及抗寒種質(zhì)的選育提供相應(yīng)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

冬小麥（Triticum aestivum L.）品種東農(nóng)冬麥1號和濟麥22由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥?zhǔn)姨峁?。東農(nóng)冬麥1號耐受的最低極限溫度可達(dá)-30～-35℃，在黑龍江省可以越冬，返青率大于85%；濟麥22耐受的最低極限溫度為-10～-15℃，在黑龍江省不能越冬，返青率小于1%。

1.2 方法

試驗材料大田生長季種植（9月），于最低溫度穩(wěn)定7 d通過5℃和-15℃時，每個材料隨機選取10株，在靠近主脈處切取葉片，3次重復(fù)。

1.2.1 顯微結(jié)構(gòu)觀察

制作石蠟切片：葉片（0.5 cm×0.5 cm）用FAA固定24 h，70%、85%、95%、100%梯度酒精漸次脫水（每一級間隔2 h），經(jīng)1/2二甲苯+1/2酒精過渡到純二甲苯透明，浸蠟包埋，切片（厚度約10 μm），番紅-固綠雙染色，中性樹膠封片。顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡樣品制作：葉片（1 mm×3 mm小條）用2.5%、pH 6.7戊二醛溶液固定，經(jīng)0.1 mol·L-1磷酸緩沖液沖洗3次，用1%鋨酸固定，磷酸緩沖液沖洗3次后乙醇梯度脫水，Epon812包埋劑包埋，LKB-V型超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重染色，JEM-1200EX透射電鏡觀察、測定并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片顯微結(jié)構(gòu)比較

葉片距主脈中心1 cm處的橫切面結(jié)構(gòu)見圖1。東農(nóng)冬麥1號和濟麥22在5℃和-15℃時均可清晰觀察到表皮、葉肉細(xì)胞及維管束。上下表皮細(xì)胞狹長形，排列整齊；葉肉細(xì)胞無柵欄組織和海綿組織之分，全部由海綿狀薄壁細(xì)胞組成，細(xì)胞間隙很大。在-15℃時，濟麥22葉肉細(xì)胞排列較東農(nóng)冬麥1號混亂。

2.2 葉片超微結(jié)構(gòu)比較

葉肉細(xì)胞的整體情況如圖2所示。在5℃時，東農(nóng)冬麥1號和濟麥22的葉肉細(xì)胞中央均有一個大液泡，液泡周圍是一薄層細(xì)胞質(zhì)，內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器。葉綠體呈橢圓狀，非常整齊地單行排列在細(xì)胞壁周邊，細(xì)胞中清晰可見一個處于旺盛代謝狀態(tài)的細(xì)胞核分布于細(xì)胞的一側(cè)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大多分布于細(xì)胞壁附近。線粒體多呈橢圓形，分布于兩個葉綠體之間（見圖3）。在-15℃時抗寒性較弱的濟麥22部分細(xì)胞的液泡膜收縮明顯，大液泡分割成幾個小液泡，葉綠體向一側(cè)聚集，排列發(fā)生混亂。細(xì)胞出現(xiàn)少量小空泡；而東農(nóng)冬麥1號變化不大。從單個葉肉細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目來比較，東農(nóng)冬麥1號略多于濟麥22，且-15℃低溫時比5℃低溫時多。

葉肉細(xì)胞中葉綠體結(jié)構(gòu)見圖3。東農(nóng)冬麥1號在5℃和-15℃時，葉綠體結(jié)構(gòu)均完整，呈橢圓形，類囊體基粒片層和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，跺疊整齊，沿葉綠體的長軸方向平行排列，均勻分布于葉綠體中；濟麥22在5℃和-15℃時，葉綠體內(nèi)類囊體排列方向不規(guī)則，-15℃較5℃時方向更紊亂。葉綠體中類囊體的基粒片層和基質(zhì)片層放大結(jié)構(gòu)見圖4。在5℃和-15℃低溫時，東農(nóng)冬麥1號和濟麥22基粒片層和基質(zhì)片層均很完整，未見空泡化現(xiàn)象。

由圖5可知，在5℃時，東農(nóng)冬麥1號和濟麥22線粒體呈橢圓形，內(nèi)部均勻分布著大量的嵴，嵴呈線形；而-15℃時，線粒體腫脹呈圓形，嵴的結(jié)構(gòu)模糊或呈小泡狀，濟麥22有個別線粒體的嵴出現(xiàn)消失現(xiàn)象（如圖5箭頭所示）。

圖4 東農(nóng)冬麥1號和濟麥22類囊體片層結(jié)構(gòu)（30 000×）Fig.4 Thylakoid lamellar structure in Dongnongdongmai1 and Jimai22 monoplast（30 000×）

圖5 東農(nóng)冬麥1號和濟麥22線粒體結(jié)構(gòu)（50 000×）Fig.5 Mitochondria structure in Dongnongdongmai1 and Jimai22（50 000×）

3 討論與結(jié)論

大量對植物抗寒性與解剖結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究指出抗寒的指標(biāo)有多種，如伴隨著低溫出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象[10]、細(xì)胞間隙大[6]，葉綠體中淀粉粒減少[11-12]，脂質(zhì)球多[6]，線粒體嵴消失[13]等。

苗芳等從小麥葉片橫切片上觀察到[14-15]：冷型小麥的葉肉細(xì)胞小，排列緊密，細(xì)胞層數(shù)較多；葉綠體數(shù)量多，葉綠體基粒片層豐富，葉肉細(xì)胞中由于大液泡的存在，葉綠體沿細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)排列；葉脈間的距離小，單位葉片寬度內(nèi)維管束的數(shù)目多，橫截面積大。葉肉細(xì)胞排列疏松、間隙大，有利于防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰[5]；細(xì)胞體積小則表面積大，以便細(xì)胞內(nèi)的水分經(jīng)較短距離遷移出細(xì)胞，不易造成細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰傷害[16]。本試驗結(jié)果表明，在5℃和-15℃低溫下，東農(nóng)冬麥1號和濟麥22葉片的橫切結(jié)構(gòu)有很多相似之處，如均表現(xiàn)為葉肉細(xì)胞很小，細(xì)胞層數(shù)較多，葉肉細(xì)胞間隙較大，線粒體形狀均為圓或橢圓形，均未發(fā)現(xiàn)淀粉粒及脂質(zhì)球，與前人研究結(jié)果一致，即都表現(xiàn)出一定的抗寒結(jié)構(gòu)特征。

董合鑄等研究表明[7]，強抗寒性冬小麥品種的葉綠體在-9℃處理2 d后結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，中等抗寒性的品種葉綠體發(fā)生腫脹，趨向橢圓形，片層彎曲；弱抗寒性的品種葉綠體嚴(yán)重破壞，類囊體發(fā)生空泡化等；強抗寒和中等抗寒性的冬小麥線粒體結(jié)構(gòu)均未發(fā)生變化，而不抗凍的材料線粒體膨脹變圓，內(nèi)嵴遭破壞。一些研究表明，在低溫寒害中，線粒體比葉綠體表現(xiàn)出明顯的相對穩(wěn)定，當(dāng)葉綠體的片層排列方向已強烈改變、類囊體產(chǎn)生空泡時，線粒體尚保持正常，或只表現(xiàn)輕度膨脹；當(dāng)葉綠體解體時，線粒體內(nèi)嵴雖遭破壞，但仍維持其個體完整性，甚至細(xì)胞已被凍害致死時，其線粒體仍保持很強的呼吸活性[17]。本試驗發(fā)現(xiàn)，東農(nóng)冬麥1號在5℃和-15℃低溫下的葉綠體及線粒體結(jié)構(gòu)變化不很明顯，而濟麥22在-15℃低溫下，其類囊體基粒片層排列明顯發(fā)生混亂，并且出現(xiàn)了線粒體的嵴消失現(xiàn)象，這說明濟麥22在-15℃低溫下其線粒體受到的破壞比葉綠體嚴(yán)重，與前人的研究結(jié)果不盡一致。而且Nir等曾報道[18]，玉米根尖在干燥條件下因失水也會導(dǎo)致電鏡觀察線粒體膨脹、變圓、內(nèi)嵴消失；但線粒體細(xì)胞色素氧化酶的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)定位發(fā)現(xiàn)，電鏡下能夠清楚地觀察到內(nèi)嵴的存在，其原因是干旱使線粒體內(nèi)膜和內(nèi)嵴膜的膜脂和蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變，前者用普通的戊二醛-鋨酸雙固定不能被染色，但內(nèi)膜和嵴上的細(xì)胞色素氧化酶并沒有因干旱失水而失活，因此，經(jīng)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)處理后，在電鏡下又可看到了嵴的結(jié)構(gòu)。因此，用葉綠體及線粒體結(jié)構(gòu)變化來鑒別分析冬小麥抗寒性機制時，需綜合考慮多方面因素。

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