宋世威 李 珍 劉厚誠(chéng) 孫光聞 陳日遠(yuǎn)

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）

冬瓜（Benincasa hispidaCogn.）為葫蘆科一年生草本植物，起源于中國(guó)南部和印度，我國(guó)主要分布在廣東、廣西、湖南、福建、江蘇、浙江、四川、湖北、安徽、河南、河北等省。節(jié)瓜（Benincasa hispidavar.chieh-quaHow）又名毛瓜、毛節(jié)瓜，是我國(guó)的特產(chǎn)蔬菜，主要分布在廣東、廣西、海南等地，在北方部分地區(qū)作為特菜栽培。節(jié)瓜是冬瓜的一個(gè)變種，兩者的親緣關(guān)系較近。前人從生物學(xué)性狀研究了冬瓜和節(jié)瓜的種質(zhì)資源（李文嘉 等，1996；謝大森 等，2009），但由于兩者的遺傳背景較狹窄，同名異物或同物異名現(xiàn)象非常普遍，僅利用生物學(xué)性狀進(jìn)行區(qū)分和鑒定有較大難度。

RAPD分子標(biāo)記技術(shù)由于產(chǎn)物的多態(tài)性較強(qiáng)，廣泛用于葫蘆科作物，如黃瓜（Horejsi & Staub，1999；李錫香 等，2004）、南瓜（Gwanama et al.，2000；李俊麗 等，2005）、西瓜（Zhang &Rhodes，1993；郭軍 等，2002）、絲瓜（夏軍輝和向長(zhǎng)萍，2008）、瓠瓜（高山 等，2007）及西葫蘆（陳鳳真和何啟偉，2010）等的遺傳多樣性研究，而關(guān)于冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)遺傳多樣性的研究較少（陳清華 等，2003）。本試驗(yàn)利用RAPD技術(shù)分析41份冬瓜和節(jié)瓜栽培品種的遺傳多樣性，探討其親緣關(guān)系，為冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2008年3～6月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜試驗(yàn)基地進(jìn)行。供試冬瓜和節(jié)瓜材料共41份，其中冬瓜18份，節(jié)瓜23份，均為商品種，供試材料名稱、來(lái)源及農(nóng)藝性狀見(jiàn)表1。供試種子用55～65 ℃溫水浸泡8 h后，置于30 ℃培養(yǎng)箱中催芽，待芽長(zhǎng)0.5 cm時(shí)播于育苗盤中，植株長(zhǎng)至4～6片真葉時(shí)取樣。

表1 供試材料名稱、來(lái)源及農(nóng)藝性狀

續(xù)表

1.2 DNA提取和RAPD分析

采用改良的CTAB法提取冬瓜和節(jié)瓜總DNA（Aljanabi & Martinez，1997），用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm處測(cè)定OD值，以檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，稀釋到5 ng·μL-1作為PCR擴(kuò)增的模板。

經(jīng)正交優(yōu)化確定冬瓜和節(jié)瓜RAPD的最佳體系:25 μL反應(yīng)體系中含1×buffer，模板DNA 20 ng、Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.24 mmol·L-1、引物 0.3 μmol·L-1和Taq酶 1 U。最適宜的退火溫度是36.9 ℃。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，36.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在含0.5 μg·mL-1EB的1.8 %瓊脂糖凝膠中電泳2 h，用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

1.3 聚類分析和主坐標(biāo)分析

將電泳圖譜清晰且可重復(fù)的DNA條帶記為1，同一位置上的弱帶且不重復(fù)或未出現(xiàn)條帶的記為0，形成1和0數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYSpc（2.10）數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行聚類分析和主坐標(biāo)分析。用SimQual程序求相似性系數(shù)矩陣，用SAHN程序中的UPGMA方法進(jìn)行聚類分析；用DCENTER程序進(jìn)行系數(shù)矩陣轉(zhuǎn)換，并用EIGEN程序求特征值和特征向量進(jìn)行主坐標(biāo)分析，用Tree plot模塊生成聚類圖，構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，用3Dplot生成主坐標(biāo)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬瓜和節(jié)瓜DNA的RAPD多態(tài)性分析

從455條隨機(jī)引物中篩選出能夠產(chǎn)生穩(wěn)定、清晰多態(tài)性擴(kuò)增譜帶的23條引物，23條引物對(duì)供試的41個(gè)冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)共產(chǎn)生143條擴(kuò)增譜帶（引物序列及擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2），其中多態(tài)性譜帶81條，多態(tài)性檢測(cè)率為56.6 %，平均每條引物產(chǎn)生6.2條譜帶。圖1、2分別為引物AX09和M16對(duì)41份種質(zhì)基因組DNA擴(kuò)增的RAPD帶型。

不同引物擴(kuò)增的譜帶數(shù)不同，其中擴(kuò)增譜帶數(shù)最多的引物是 E03，擴(kuò)增出 11條，其中多態(tài)性譜帶7條；擴(kuò)增譜帶數(shù)最少的引物是AT08，僅擴(kuò)增出2條。引物F09擴(kuò)增譜帶的多態(tài)性比例最高，達(dá)到88.9 %，AX05和AY16的最低，僅為20.0 %（表2）。

表2 篩選出的引物序列及擴(kuò)增結(jié)果

圖1 引物AX 09對(duì)41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)基因組DNA擴(kuò)增的RAPD帶型

圖2 引物M16對(duì)41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)基因組 DNA擴(kuò)增的RAPD帶型

2.2 聚類分析

利用143條RAPD擴(kuò)增譜帶，用UPGMA法建立了41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)間的遺傳關(guān)系聚類分析圖（圖3）。聚類分析結(jié)果表明，41份種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.60～0.99之間。25號(hào)材料粵農(nóng)豐節(jié)瓜和30號(hào)材料粵農(nóng)6號(hào)節(jié)瓜的相似系數(shù)達(dá)0.99，表明兩者的親緣關(guān)系非常近，田間農(nóng)藝性狀完全一致，說(shuō)明這兩個(gè)品種是同物異名；3號(hào)和5號(hào)兩份材料商品名均為特大粉皮冬瓜，但兩者的相似系數(shù)較小，為0.72，田間農(nóng)藝性狀也有較大差別，說(shuō)明這兩個(gè)品種是同名異物。在遺傳相似系數(shù)0.71處可將供試的41份種質(zhì)劃分為6大類群9個(gè)亞類。

第Ⅰ類只有1份材料——特大粉皮冬瓜（3號(hào)），來(lái)源河北，早熟，大果類型，果實(shí)長(zhǎng)筒形，果皮白綠色，密被毛刺和白色蠟粉。

第Ⅱ類也只有1份材料——廣利粉皮冬瓜（19號(hào)），來(lái)源廣東，中晚熟，大果類型，果實(shí)扁圓柱形，果形指數(shù)小于1，果皮白綠色被厚粉。

第Ⅲ類包括2份節(jié)瓜材料——長(zhǎng)身黃毛節(jié)（16號(hào)）和5號(hào)黑毛節(jié)（17號(hào)），來(lái)源廣東，早熟，果實(shí)長(zhǎng)圓柱形，果形指數(shù)大，果皮表面星點(diǎn)多。

第Ⅳ類包括 5份材料，可分為兩個(gè)亞類。① 揚(yáng)子江粉皮大冬瓜（2號(hào)）、粉皮冬瓜（4號(hào)）和特大粉皮冬瓜（5號(hào)），分別來(lái)源于江西、北京和河北，早熟和中晚熟，大果類型，果皮白綠色，蠟粉重。② 薊農(nóng)一串鈴冬瓜（6號(hào)）和一串鈴冬瓜（7號(hào)），分別來(lái)源于天津和北京，早熟，小果類型，果皮青綠色，果形指數(shù)較小。

第Ⅴ類包括8份材料，可分為兩個(gè)亞類。① 臺(tái)灣特大黑皮冬瓜（1號(hào)）、廣東黑皮冬瓜（888）（13號(hào)）、碧玉出口節(jié)瓜（14號(hào)）、夏冠1號(hào)節(jié)瓜（15號(hào)）、廣優(yōu)1號(hào)節(jié)瓜（18號(hào)）和粵農(nóng)6號(hào)節(jié)瓜（30號(hào)）。兩份冬瓜分別來(lái)源于北京和廣東，早熟，大果類型，果皮墨綠色；4份節(jié)瓜均來(lái)源于廣東，果皮翠綠或深綠色。② 黑先鋒雜交大冬瓜（21號(hào)）和廣東黑皮冬瓜（22號(hào)），來(lái)源于廣東，早熟，大果類型，果實(shí)長(zhǎng)圓柱形，果皮墨綠色。

第Ⅵ類包括24份材料，可分為兩個(gè)亞類。① 一串鈴4號(hào)冬瓜（8號(hào)）和精選一串鈴冬瓜（35號(hào)），均來(lái)源于北京，小果類型，果實(shí)高樁形，果皮青綠色。② 其余22份材料，包括5份冬瓜和17份節(jié)瓜。

圖3 41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)的RAPD標(biāo)記聚類圖

2.3 主坐標(biāo)分析

對(duì)RAPD標(biāo)記所獲得相似系數(shù)矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析，第一、第二和第三個(gè)主坐標(biāo)方差貢獻(xiàn)率分別為32.06 %、9.17 %和7.52 %，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率48.75 %。41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)在第一主坐標(biāo)方向上被分為3類，在第二主坐標(biāo)方向上被分為2類，將第一和第二主坐標(biāo)作用綜合起來(lái)考慮可將41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)分為6大類群（圖4），這與聚類分析結(jié)果相近。

第Ⅰ類，一串鈴4號(hào)冬瓜（8號(hào)）和精選一串鈴冬瓜（35號(hào)）；第Ⅱ類，特大粉皮大冬瓜（3號(hào)）；第Ⅲ類，揚(yáng)子江粉皮冬瓜（2號(hào)）、粉皮冬瓜（4號(hào)）、特大粉皮冬瓜（5號(hào)）、薊農(nóng)一串鈴冬瓜（6號(hào)）和一串鈴冬瓜（7號(hào)）；第Ⅳ類，臺(tái)灣特大黑皮冬瓜（1號(hào)）、廣東黑皮冬瓜（888）（13號(hào)）、黑先鋒雜交大冬瓜（21號(hào)）、廣東黑皮冬瓜（22號(hào)）、碧玉出口節(jié)瓜（14號(hào)）、夏冠1號(hào)節(jié)瓜（15號(hào)）、粵農(nóng)節(jié)瓜（20號(hào)）、長(zhǎng)身黃毛節(jié)（16號(hào)）和 5號(hào)黑毛節(jié)（17號(hào)）；第Ⅴ類，廣優(yōu) 1號(hào)節(jié)瓜（18號(hào)）和廣利粉皮冬瓜（19號(hào)）；第Ⅵ類包括22份其余種質(zhì)。

圖4 41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)二維主坐標(biāo)圖

在第一、第二主坐標(biāo)分組的基礎(chǔ)上，結(jié)合第三主坐標(biāo)，41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)可分為 6大類群10個(gè)亞類（圖5）。第Ⅰ類分為2個(gè)亞類:① 一串鈴4號(hào)冬瓜（8號(hào)）；② 精選一串鈴冬瓜（35號(hào)）。第Ⅱ、第Ⅲ和第Ⅴ類在第三坐標(biāo)方向上沒(méi)有再細(xì)分，說(shuō)明第一、第二主坐標(biāo)的信息足以將其區(qū)分開(kāi)。第Ⅳ類分為2個(gè)亞類:① 長(zhǎng)身黃毛節(jié)（16號(hào)）、5號(hào)黑毛節(jié)（17號(hào)）、粵農(nóng)節(jié)瓜（20號(hào)）、碧玉出口節(jié)瓜（14號(hào)）和廣東黑皮冬瓜（22號(hào)）；② 臺(tái)灣特大黑皮冬瓜（15號(hào)）、廣東黑皮冬瓜（888）（13號(hào)）、黑先鋒雜交大冬瓜（21號(hào)）和夏冠1號(hào)節(jié)瓜（15號(hào)）。第Ⅵ類分為3個(gè)亞類:① 粵農(nóng)208節(jié)瓜（37號(hào)）、七星節(jié)瓜（38號(hào)）、新會(huì)七江黑毛節(jié)瓜（39號(hào)）、特選種黑毛節(jié)瓜（41號(hào)）和江門利隆8號(hào)雜優(yōu)連環(huán)節(jié)瓜（40號(hào)）；② 旺優(yōu)七星節(jié)瓜（31號(hào)）、為農(nóng)高產(chǎn)節(jié)瓜（32號(hào)）、為農(nóng)節(jié)瓜（33號(hào)）和粵冠節(jié)瓜（34號(hào)）；③ 其余13份材料。

圖5 41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)的三維主坐標(biāo)圖

通過(guò)比較圖 3、4、5可知，對(duì) 41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)進(jìn)行的系統(tǒng)聚類分析和主坐標(biāo)分析的結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論與討論

從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，采用RAPD技術(shù)對(duì)冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)資源進(jìn)行多態(tài)性分析，構(gòu)建了41份冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)的聚類分析圖和主坐標(biāo)分析圖，表明RAPD技術(shù)能有效地檢測(cè)冬瓜和節(jié)瓜材料間的遺傳變異，對(duì)其遺傳多樣性分析是可行的。

本試驗(yàn)中采用聚類分析和主坐標(biāo)分析所獲得的結(jié)果基本一致。特大粉皮冬瓜（3號(hào)）單獨(dú)為一類，揚(yáng)子江粉皮冬瓜、粉皮冬瓜、特大粉皮冬瓜（5號(hào)）、薊農(nóng)一串鈴冬瓜和一串鈴冬瓜為一類，這與聚類分析結(jié)果一致；豐青1號(hào)是冬瓜和節(jié)瓜兼用品種，在主坐標(biāo)分析中表現(xiàn)出與湖南的冬瓜種質(zhì)和部分節(jié)瓜品種較近的親緣關(guān)系；一串鈴4號(hào)冬瓜和精選一串鈴冬瓜在主坐標(biāo)分析中也被分到2個(gè)亞類。冬瓜和節(jié)瓜的分子標(biāo)記與種質(zhì)的果實(shí)大小、性狀和果皮顏色密切相關(guān)。

系統(tǒng)聚類分析能提供豐富的數(shù)量信息，量化地體現(xiàn)冬瓜和節(jié)瓜種質(zhì)之間的關(guān)系。主坐標(biāo)分析能從不同的方向和層面更直觀地提供更多的關(guān)于冬瓜和節(jié)瓜各種質(zhì)或群體的關(guān)系。因此，將聚類分析和主坐標(biāo)分析結(jié)合起來(lái)使用，可以互相印證和補(bǔ)充。在遺傳距離計(jì)算方法一致的情況下，采用主坐標(biāo)分析方法，對(duì)闡明冬瓜和節(jié)瓜間的親緣關(guān)系能提供更全面的信息。

RAPD分析結(jié)果顯示，冬瓜和節(jié)瓜最終沒(méi)有聚成兩大類，而是互有交叉地分散到6大類群中。這表明冬瓜和節(jié)瓜的親緣關(guān)系很近，從分子水平上進(jìn)一步證明其屬于同一個(gè)種的不同變種。冬瓜各品種的相似系數(shù)多集中在0.60～0.80之間，而節(jié)瓜各品種的相似系數(shù)多集中在0.80～0.99之間，表明冬瓜的遺傳多樣性大于節(jié)瓜。這與兩個(gè)物種材料的來(lái)源密切相關(guān)，冬瓜分布范圍廣，供試的18份材料來(lái)源于7個(gè)?。欢?jié)瓜主要分布在華南地區(qū)，供試的23份材料全部來(lái)自廣東，遺傳背景狹窄。

陳鳳真，何啟偉．2010．西葫蘆種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析．中國(guó)蔬菜，（16）:26-31.

陳清華，謝大森，何曉明．2003．節(jié)瓜性型基因的RAPD標(biāo)記．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，（5）:19-21.

高山，許端祥，林碧英，鐘開(kāi)勤．2007．瓠瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析．分子植物育種，5（4）:502-506.

郭軍，許勇，壽森炎，張海英，康國(guó)斌．2002．西瓜種質(zhì)資源親緣關(guān)系的RAPD分析．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，3（1）:7-13.

李俊麗，向長(zhǎng)萍，張宏榮，楊靜．2005．南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析．園藝學(xué)報(bào)，32（5）:834-839.

李文嘉，方鋒學(xué)，黃如葵，鄧征宇．1996．廣西優(yōu)良冬瓜節(jié)瓜種質(zhì)資源．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，（6）:288-289.

李錫香，朱德蔚，杜永臣，張廣平，沈鏑．2004．黃瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的 RAPD鑒定與分類研究．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，5（2）:147-152.

夏軍輝，向長(zhǎng)萍．2008．絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的形態(tài)和RAPD標(biāo)記分析．中國(guó)蔬菜，（10）:21-25.

謝大森，何曉明，彭慶務(wù)．2009．冬瓜種質(zhì)資源的綜合鑒評(píng)．中國(guó)蔬菜，（8）:36-41.

Aljanabi S M，Martinez I．1997．Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques．Uncleic Acids Research，25（22）:4692-4693.

Gwanama C，Labuschagne MT，Botha A M．2000．Analysis of genetic variation in cucurbita moschata by randoMamplified polymorphic DNA（RAPD）markers．Euphytica，113:19-24.

Horejsi T，Staub J E．1999．Genetic variation in cucumber（Cucumis sativusL.）as assessed by randoMamplified polymorphic DNA．Genetic Resources and Crop Evolution，46:337-350.

Zhang X P，Rhodes B B．1993．RAPD molecular marker in watermelon．HortScience，18（5）:223.