方 芳,秦 宇,2,郭勁松,賈 麗,楊國紅

(1.重慶大學(xué)城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院,重慶400045;2.重慶交通大學(xué) 河海學(xué)院,重慶400074)

單級自養(yǎng)脫氮工藝是新型生物脫氮工藝的一種,在處理低碳高氨廢水上具有簡易、高效、低耗等特點(diǎn)而具有較大的潛力,成為生物脫氮領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)[1-3]。不少學(xué)者從溶解氧(DO)、氨氮負(fù)荷率、具有自養(yǎng)脫氮功能的污泥富集形式等對該工藝的實(shí)現(xiàn)和運(yùn)行進(jìn)行了探討[4-7]。由于該工藝研發(fā)較晚,目前對其微觀作用機(jī)理研究仍顯滯后。主流觀點(diǎn)認(rèn)為,系統(tǒng)內(nèi)主要功能菌為亞硝化菌(ammonium oxidizing bacteria,AOB)、硝化菌(nitrite oxidizing bacteria,NOB)及厭氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidizing bacteria,ANAMMOX)3大類自養(yǎng)菌[7-10]。由于自養(yǎng)菌世代周期較長,且難以模擬其生長繁殖的條件而不能獲得細(xì)菌的純培養(yǎng),加上系統(tǒng)內(nèi)微生物的多樣性,使得傳統(tǒng)微生物學(xué)方法不能完全滿足自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)微觀層面的研究。近年來,采用生物標(biāo)記技術(shù),特別是以16S rDNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù),在環(huán)境領(lǐng)域應(yīng)用研究的迅速發(fā)展[11-13],使得掌握該工藝中主要功能菌的微生物群落結(jié)構(gòu)及微生物多樣性,并探討數(shù)量和結(jié)構(gòu)對反應(yīng)器效能的影響成為可能。

該文從宏觀控制參數(shù)條件相同、運(yùn)行穩(wěn)定但效能有明顯差異的2套序批式生物膜單級自養(yǎng)脫氮(SBBR)反應(yīng)器中,采集生物膜及活性污泥樣品,利用變性凝膠梯度(PCR-DGGE)、實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)等技術(shù)對其進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)研究,了解SBBR自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)的微生物組成、群落結(jié)構(gòu)及其影響因素,分析宏觀運(yùn)行效能與自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)微觀組成相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)裝置如圖1所示,共有A、B 2組有機(jī)玻璃反應(yīng)器同時(shí)運(yùn)行,反應(yīng)器有效容積均為30 L。其中A反應(yīng)器應(yīng)用了空心球與彈性填料組合,而B反應(yīng)器只采用軟性填料。

研究采用人工配液進(jìn)行試驗(yàn),即稱取適量的NH4HCO3加入自來水中,控制進(jìn)水約為160 mg/L。加入一定量的NaHCO3調(diào)節(jié)進(jìn)水p H值為8(±0.2);加入適量的KH2PO4作為微生物代謝所需的磷源;按每L溶液2 mL微量元素貯存液加入反應(yīng)器。系統(tǒng)保持在30℃條件下運(yùn)行,HRT為2 d,不人工排泥?？刂葡到y(tǒng)溫度在30℃左右。

圖1 試驗(yàn)裝置示意圖

A、B系統(tǒng)前期分別在DO為0.8～1.5 mg/L和1.5～2.0 mg/L連續(xù)曝氣的狀態(tài)下完成了啟動(dòng),但脫氮效能不理想,之后將供氧方式改為間歇曝氣,并控制反應(yīng)器DO均為2.0～2.5(曝氣)/0.2～0.4(停曝)mg/L,曝停比2 h:2 h[14]。在該控制條件下,A、B 2組反應(yīng)器的運(yùn)行效能有所提高,均具有一定的氨氮轉(zhuǎn)化率及總氮去除率,研究在該條件下取樣進(jìn)行。

1.2 DNA提取

分別從反應(yīng)器中采取活性污泥樣品及生物膜樣品,于10 000 rpm高速離心5 min,取沉淀污泥約100 mg,按文獻(xiàn)[15]方法提取樣品DNA。

1.3 PCR-DGGE

PCR擴(kuò)增、DGGE電泳的具體運(yùn)行條件及圖譜相關(guān)性分析詳見文獻(xiàn)[15]。

1.4 Real-time PCR

分別選用好氧氨氧化菌(AOB)、亞硝酸氧化菌(NOB)及厭氧氨氧化菌(ANAMMOX)特異性引物用以real-time PCR,表1為各類細(xì)菌的PCR引物。以各細(xì)菌序列片段的 T質(zhì)粒載體克隆作為定量標(biāo)準(zhǔn)品,采用TA粘末端克隆法制備重組質(zhì)粒,將其進(jìn)行倍比稀釋后在熒光定量PCR檢測中利用標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增得到定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品進(jìn)行定量分析。具體操作詳見文獻(xiàn)[16-18]。

表1 各類細(xì)菌PCR引物

1.5 分析測試項(xiàng)目與方法

懸浮固體(SS)和揮發(fā)性懸浮固體(VSS):標(biāo)準(zhǔn)重量法[19];pH:Sension2型便攜式p H/ISE測量儀;溶解氧:LDOTMHQ10便攜式溶解氧測量儀;COD:重鉻酸鉀-硫酸銀氧化法;總氮:過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法[19];亞硝酸鹽:N-1-奈基-乙二胺比色法[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)器運(yùn)行

A反應(yīng)器進(jìn)出水各形態(tài)氮濃度及系統(tǒng)運(yùn)行效能如圖2所示。該反應(yīng)器出水水質(zhì)在本試驗(yàn)階段穩(wěn)定,進(jìn)行監(jiān)測的70余天內(nèi),出水氨氮濃度保持在0～17 mg/L,轉(zhuǎn)化率超過90%;總氮濃度約25 mg/L左右,去除率介于81%～87%。

圖2 A反應(yīng)器氮轉(zhuǎn)化關(guān)系圖

B反應(yīng)器進(jìn)出水水質(zhì)如圖3所示。在試驗(yàn)過程中,反應(yīng)器出水氨氮在70～90 mg/L范圍波動(dòng),好氧氨氧化過程反應(yīng)不充分,系統(tǒng)只有40%～60%左右的氨氮轉(zhuǎn)化率,系統(tǒng)內(nèi)基本上無NO2--N積累,NO3--N除少數(shù)幾天濃度低于10 mg/L外,一直在30～40 mg/L波動(dòng)。由 NH4+-N氧化生成的NO2--N很大一部分又被進(jìn)一步氧化成NO3--N,其余與殘余NH 4+-N發(fā)生了厭氧氨氧化過程,所以系統(tǒng)TN去除率不高,除個(gè)別時(shí)候達(dá)到40%外,其余試驗(yàn)期間均僅在20%～30%。與A反應(yīng)器相比,B反應(yīng)器同期時(shí)間內(nèi)運(yùn)行效能明顯較差。

圖3 B反應(yīng)器氮轉(zhuǎn)化關(guān)系圖

2.2 反應(yīng)器微生物群落結(jié)構(gòu)

圖4 、圖5分別為SBBR自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)接種污泥及A、B反應(yīng)器中活性污泥與生物膜樣品DNA(a)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(b)瓊脂糖凝膠電泳圖譜和DGGE結(jié)果。

圖4 DNA(I)及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(II)瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖5 PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜及其強(qiáng)度分析

圖4中從左到右分別為:Marker(λ-HindⅢ)、接種污泥、A反應(yīng)器活性污泥、A反應(yīng)器生物膜、B反應(yīng)器活性污泥、B反應(yīng)器生物膜。

圖5顯示,接種污泥樣品條帶數(shù)明顯多于馴化后的SBBR自養(yǎng)脫氮系統(tǒng),相比于接種污泥,穩(wěn)定運(yùn)行的SBBR自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)種群多樣性降低,這是由于在整個(gè)馴化過程中,人工配液里不含有機(jī)碳源,隨著反應(yīng)器內(nèi)有機(jī)碳源的減少,系統(tǒng)中自養(yǎng)細(xì)菌在和異養(yǎng)細(xì)菌的競爭中逐漸占據(jù)優(yōu)勢地位,適應(yīng)能力較弱或?qū)τ袡C(jī)碳源量要求較高的異養(yǎng)細(xì)菌則被大量淘汰,從而使得該SBBR自養(yǎng)脫氮反應(yīng)器中微生物的種群結(jié)構(gòu)變得相對簡單。

A反應(yīng)器,成功啟動(dòng)后具有較高的運(yùn)行效能,氨氮轉(zhuǎn)化率超過 90%,總氮去除率達(dá)到 80%以上。DGGE條帶圖譜統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,該系統(tǒng)中,活性污泥樣品含有10條優(yōu)勢功能菌條帶,生物膜有14條,二者微生物群落豐富度值分別為0.588和0.824,相似性為58.3%。而B反應(yīng)器,從接種馴化開始,除單純采用軟性填料外,雖運(yùn)行控制條件等均與A反應(yīng)器相同,但運(yùn)行效能明顯低于A反應(yīng)器。B系統(tǒng)掛膜不理想,活性污泥與生物膜樣品微生物構(gòu)成沒有明顯差異,二者微生物群落相似性達(dá)到100%,2種樣品中均含有7條條帶,微生物群落豐富度值為0.412。試驗(yàn)同期測得A與B反應(yīng)器內(nèi)活性污泥濃度分別為728 mg/L和757 mg/L,生物膜濃度分別為844 mg/L和433 mg/L。顯然,與A反應(yīng)器相比,B反應(yīng)器中活性污泥濃度與之相當(dāng),但生物膜濃度卻只有A反應(yīng)器生物膜的一半左右。若將相同比表面積下生物膜厚度與生物膜濃度視為正比關(guān)系,則可以認(rèn)為B反應(yīng)器中生物膜沒有較好形成,厚度較薄,難以在膜內(nèi)形成DO梯度,故膜內(nèi)DO的分布可以視為與完全混合的活性污泥相當(dāng),使得生物膜與活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著差異。

2.3 SBBR自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)功能菌定量化研究

A、B反應(yīng)器各類功能菌熒光定量PCR結(jié)果見圖6。

圖6 A、B系統(tǒng)功能菌數(shù)量示意圖

由圖6可以看出,AOB在A反應(yīng)器中數(shù)量明顯多于B反應(yīng)器,活性污泥和生物膜樣品分別比B系統(tǒng)高出2個(gè)和1個(gè)數(shù)量級。AOB在自養(yǎng)脫氮過程中負(fù)責(zé)氨氮轉(zhuǎn)化的第一步,以NH4+-N為底物,將其氧化為NO2--N,豐富的AOB數(shù)量使得A系統(tǒng)具有較高的氨氮轉(zhuǎn)化率,達(dá)到90%左右。B系統(tǒng)AOB較A系統(tǒng)少,有限的AOB只能將一部分NH 4+-N進(jìn)行代謝,從而直接影響到系統(tǒng)后續(xù)的運(yùn)行效能。

NOB在A、B系統(tǒng)中的分布與AOB有較大差別,該類細(xì)菌在A反應(yīng)器中不占優(yōu)勢,與其它功能菌相比,相差2～3個(gè)數(shù)量級,但在B系統(tǒng)中,NOB數(shù)量級與AOB相當(dāng)。造成該現(xiàn)象的原因有2點(diǎn):1)A系統(tǒng)前期在DO=0.8～1.5 mg/L連續(xù)曝氣的狀態(tài)下啟動(dòng),而B系統(tǒng)啟動(dòng)時(shí)DO=1.5～2.0 mg/L。有研究表明[20],在溶解氧濃度較低的情況下,AOB與NOB的增長速率均下降,但NOB的下降趨勢比AOB要快。低DO濃度,尤其是在 DO低于1.0 mg/L的情況下,AOB與NOB的競爭中AOB比較有利。所以在A系統(tǒng)中NOB數(shù)量上不占優(yōu),而B系統(tǒng)中NOB與AOB數(shù)量相當(dāng),從而推動(dòng)了NO2-向NO3-的轉(zhuǎn)化;2)B系統(tǒng)在前期啟動(dòng)過程中有較多的NO2--N積累,由于系統(tǒng)沒有較好地形成生物膜,缺乏足夠的厭氧環(huán)境,阻礙了厭氧菌ANAMMOX的代謝,積累的NO2--N很大程度上為NOB的代謝提供了充足的底物,為NOB所利用。以上2點(diǎn)原因造成B系統(tǒng)中NOB沒有被完全“洗脫”,在該系統(tǒng)中數(shù)量較多,成為了優(yōu)勢功能菌。從B系統(tǒng)運(yùn)行效能圖(圖3)中也可以看出,B反應(yīng)器內(nèi)NO3--N濃度較高,一直在30～40 mg/L波動(dòng),由NH4+-N氧化生成的NO2--N很大一部分又被進(jìn)一步氧化成NO3--N。

ANAMMOX無論在A反應(yīng)器還是B反應(yīng)器,數(shù)量上均為占優(yōu)的。運(yùn)行效能優(yōu)秀的A反應(yīng)器中ANAMMOX數(shù)量級達(dá)到1012,而脫氮效果不好的B系統(tǒng)中數(shù)量級僅為1010,說明ANAMMOX的數(shù)量在一定程度上直接與整個(gè)系統(tǒng)的脫氮效能相關(guān),ANAMMOX數(shù)量越多,系統(tǒng)出水的水質(zhì)越高。

3 討論

目前,單級自養(yǎng)脫氮工藝氮去除機(jī)理的主流觀點(diǎn)認(rèn)為:系統(tǒng)內(nèi)氨氮首先由AOB將之部分氧化為亞硝氮,剩余的氨氮再和第一步反應(yīng)生成的亞硝態(tài)氮在ANAMMOX作用下進(jìn)一步反應(yīng)生成氮?dú)鈁8-9]。AOB為好氧菌,而 ANAMMOX對氧氣相當(dāng)敏感[21]。因此,若想使SBBR自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)具有良好的運(yùn)行效能,其技術(shù)關(guān)鍵是控制反應(yīng)器中的溶解氧濃度,創(chuàng)造一個(gè)既利于AOB又不阻礙ANAMMOX代謝的微生態(tài)環(huán)境,推動(dòng)亞硝化和厭氧氨氧化這2個(gè)過程順利進(jìn)行。在試驗(yàn)的控制條件下,DO為2.0～2.5(曝氣)/0.2～0.4(停曝)mg/L,曝氣時(shí)的DO濃度將對厭氧氨氧化菌正常生理代謝產(chǎn)生抑制。因此,需要利用各類微生物對DO的不同適應(yīng)性,根據(jù)生物膜內(nèi)的DO梯度,在生物膜內(nèi)有序生長。生物膜外表面溶解氧濃度較高,以好氧亞硝化菌為主;深入生物膜內(nèi)部,氧傳遞受阻,并且因外部好氧菌對氧的消耗,在生物膜深處產(chǎn)生缺氧區(qū)和厭氧區(qū),厭氧氨氧化菌將占優(yōu)勢。因此在運(yùn)行效能較好的A反應(yīng)器中,生物膜與活性污泥樣品微生物區(qū)系組成具有差異,二者相似性僅為58.3%,生物膜樣品的豐富度值高于活性污泥樣品,且脫氮功能菌 AOB、ANAMMOX數(shù)量均明顯多于B反應(yīng)器。在該系統(tǒng)中,活性污泥與生物膜之間構(gòu)成了一個(gè)微小的生態(tài)系統(tǒng),氮的去除是其中各種微生物相互平衡、協(xié)同代謝作用的結(jié)果。較高的生物膜濃度及微生物多樣性為SBBR自養(yǎng)脫氮?jiǎng)?chuàng)造了一個(gè)良好環(huán)境。

B反應(yīng)器,活性污泥與生物膜樣品中均含有7條條帶,微生物群落豐富度值為0.412,二者微生物群落相似性達(dá)到100%,活性污泥與生物膜樣品微生物構(gòu)成并沒有明顯差異,NOB在系統(tǒng)內(nèi)沒有被完全“洗脫”,功能菌AOB、ANAMMOX數(shù)量優(yōu)勢與A系統(tǒng)相比不明顯,生物膜沒有很好形成,厚度較薄。從反應(yīng)器氮轉(zhuǎn)化關(guān)系圖(圖3)中可以看出,B反應(yīng)器在運(yùn)行期間內(nèi)具有40%～60%左右的氨氮轉(zhuǎn)化率,可以認(rèn)為該反應(yīng)器能夠?qū)崿F(xiàn)自養(yǎng)脫氮的第一步:好氧亞硝化過程。但系統(tǒng)的總氮去除率只有20%～30%,轉(zhuǎn)化的氨氮以NO3--N殘留在系統(tǒng)內(nèi),只有部分發(fā)生了厭氧氨氧化過程,較差的生物膜特性沒有為厭氧氨氧化菌創(chuàng)造一個(gè)良好的代謝環(huán)境,厭氧微生物數(shù)量較低,使自養(yǎng)脫氮過程停留在好氧階段。此外,雖然B反應(yīng)器中活性污泥及生物膜2種樣品均存在多種微生物,但從DGGE圖譜中可以看出,系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢功能菌單一,帶7所代表的微生物在系統(tǒng)中顯得尤為強(qiáng)大,從而使系統(tǒng)沒有良好的微生物協(xié)同代謝過程,系統(tǒng)只完成了少量的自養(yǎng)脫氮過程,宏觀表現(xiàn)則為較差的運(yùn)行效能。

4 結(jié)論

1)在穩(wěn)定運(yùn)行的SBBR自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)內(nèi),與接種污泥相比,微生物群落結(jié)構(gòu)較為簡單,自養(yǎng)菌被富集而大量異養(yǎng)菌則被淘汰,AOB、NOB及ANAMMOX數(shù)量大幅增長,成為系統(tǒng)中優(yōu)勢功能菌。

2)運(yùn)行效能好的A反應(yīng)器,生物膜與活性污泥微生物區(qū)系組成相似性低,活性污泥與生物膜之間構(gòu)成了一個(gè)微小的生態(tài)系統(tǒng),氨氮通過各種微生物之間的相互平衡、協(xié)同代謝去除。運(yùn)行效能較差的B反應(yīng)器,由于生物膜沒有很好形成,活性污泥與生物膜的微生物群落結(jié)構(gòu)相似,功能菌單一不利于系統(tǒng)脫氮。

3)運(yùn)行效能好的A反應(yīng)器,AOB及ANAMMOX數(shù)量上與NOB相比占有絕對優(yōu)勢,系統(tǒng)能夠較好的完成NH 4+-N向NO2--N的轉(zhuǎn)換及厭氧氨氧化過程;運(yùn)行效能較差的B反應(yīng)器,NOB沒有被完全“洗脫”,系統(tǒng)中出現(xiàn)NO3--N積累,阻礙厭氧氨氧化過程,從而影響了整個(gè)脫氮效能。

4)維持SBBR自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定及平衡性,生物膜是一關(guān)鍵性因素,尤其在高DO范圍內(nèi),厭氧菌對生物膜的依賴性強(qiáng),利用生物膜內(nèi)多種微生物的協(xié)同代謝作用可以為反應(yīng)創(chuàng)造適宜條件,使系統(tǒng)有較好的運(yùn)行效能。

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