楊慶強(qiáng)，唐春燕

(瀘州醫(yī)學(xué)院:1.附屬醫(yī)院普外科;2.護(hù)理學(xué)院衛(wèi)校，四川 646000)

在適度缺氧的應(yīng)激下，腫瘤細(xì)胞的起始因子-2α被磷酸化，大多數(shù)蛋白質(zhì)的翻譯被抑制，另一方面，特定的缺氧誘導(dǎo)蛋白合成增加，由此基因表達(dá)和表型出現(xiàn)轉(zhuǎn)變，腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生改變，該反應(yīng)受缺氧程度及時(shí)間的影響[1]。作者在前期的研究中將培養(yǎng)液PO220 mm Hg作為微缺氧環(huán)境，檢測到在微缺氧下H T-29細(xì)胞骨橋蛋白(OPN)特異性的表達(dá)上調(diào)，且HT-29細(xì)胞異質(zhì)性黏附能力、侵襲游走能力顯著增強(qiáng)，MMP-2/9活性上調(diào)而向惡性表型轉(zhuǎn)化。反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASODN)是能與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)的DNA片段。應(yīng)用ASODN阻斷特定基因的表達(dá)，研究基因的功能已經(jīng)成為可能。本實(shí)驗(yàn)將靶向OPN ASODN轉(zhuǎn)染至微缺氧下高表達(dá)OPN的HT-29細(xì)胞，試圖特異性地封閉OPN m RNA，以進(jìn)一步探討OPN在微缺氧誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Lipofectamine 2000(invitrogen公司，Santa Cruz Biotechnology)，RT-PCR試劑盒(杭州博日公司)，明膠(Sigma)，matrigel基底膜基質(zhì)(BD Bioscience)，含 4.8%O2、90.2%N2和5%CO2三元混合氣體，自行設(shè)計(jì)的缺氧培養(yǎng)裝置等。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HT-29細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中貼壁生長，以0.1%胰酶傳代。在前期的實(shí)驗(yàn)中，作者用溶解氧測定儀實(shí)時(shí)監(jiān)測，已摸索出持續(xù)低流量灌注4.8%O2，培養(yǎng)液氧分壓恒定于20 mm Hg。缺氧條件參照文獻(xiàn)[2]，并稍作改進(jìn)。

1.3 ASODN的設(shè)計(jì) 在Genbank查詢OPN基因序列NM_000582，參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)并合成了由20個(gè)堿基組成的正義、反義、錯義寡核苷酸(missense oligonucleotide，MODN)。各自序列如下:ASODN 序列為 5′-CTA ACT TAA AAA ACA AAA GA-3′。正義寡核苷酸(sense oligonucleotide，SODN)序列為 5′-TCT T TT GT T TTT TAA GT T AG-3′。 MODN 序列為 5′-AGT TGC GGA AAT GAG TG-3′。

1.4 ASODN的轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞制成濃度為1×105個(gè)/m L的細(xì)胞懸液，每孔2 m L接種于 6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞增殖至60%～70%融合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入lm L含10μL/m L ODN及終濃度為10μL/m L脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染液，于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。去除轉(zhuǎn)染液，加入2 m L 10%FBS/RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，將細(xì)胞進(jìn)行微缺氧培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 RT-PCR分析 實(shí)驗(yàn)分組:微缺氧空白組、脂質(zhì)體對照組、SODN組、MODN組、ASODN組。各 ODN組均以 10 μmol/L轉(zhuǎn)染H T-29細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后再微缺氧培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞均用0.1%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液并行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)樣本收集等量細(xì)胞2×106，用T RNzol試劑抽提總 RNA，步驟按說明書進(jìn)行。在genbank查詢OPN基因序列NM_000582，用primer5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物序列，上游引物為5′-ACC CTT CCA AGT AAG TCC AAC-3′;下游引物為 5′-GGT GAT GTC C TC GTC TGT AGC-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片斷為354 bp。內(nèi)參 β-actin的上 游引物為 5′-TTG TAA CAA ACT GGG ACG ATA TGG-3′;下 游引 物為 5′-GAT CT T GAT CT T CAT GGT GCT AG-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片斷為764 bp。用逆轉(zhuǎn)錄酶和oligo-d T等按 42℃60 min，70℃10 min條件進(jìn)行cDNA的合成。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL、10×RT-PCR Buffer 5μL，MgCl23μL，d NTP Mixture 1μL，上、下游引物各 1μL 及 Taq mix DNA polymerase 0.5μL加入無菌雙蒸水至反應(yīng)總體積為50μL。反應(yīng)條件為:94℃變性3 min;94℃變性45 s，53℃退火復(fù)性45 s，72℃延伸 45 s，共 32個(gè)循環(huán)后再72℃延伸 5 min。反應(yīng)體系以β-actin作為內(nèi)參照。PC R產(chǎn)物用含溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠在Bio-Rad的UⅥ圖像處理系統(tǒng)上分析、計(jì)算，得出OPN、β-actin的光密度，以β-actin的光密度為參照物，求出OPN光密度與之相比的相對值，得到OPN m RNA表達(dá)的半定量結(jié)果。

1.6 Western blot分析 將細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶400稀釋的羊抗人骨橋蛋白多克隆抗體，4℃過夜，β-actin作內(nèi)參照。TBS T洗膜3次，10 min/次，加入1∶1000稀釋的辣根酶標(biāo)記兔抗山羊Ig G，37℃1 h，同樣洗膜3次，膜上均勻滴加ECL發(fā)光試劑，在Bio-Rad圖像處理系統(tǒng)Hisensitivity模式下連續(xù)曝光顯影，對蛋白條帶進(jìn)行灰度相對強(qiáng)度測定，得出積分灰度值，以積分值代表蛋白的表達(dá)量。

1.7 M TT檢測HT-29細(xì)胞的增殖活性 收集對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞，胰酶消化制成5×104/m L細(xì)胞懸液，以 200μL/孔接種于96孔板，常氧下、37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁。各組細(xì)胞微缺氧培養(yǎng) 6、12、24、48 h。同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞的背景對照，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。到達(dá)預(yù)設(shè)時(shí)限點(diǎn)時(shí)，每孔加入(5 mg/m L)M TT溶液20μL，37℃孵育4 h。棄舊液，每孔加入150μL DMSO，37℃，水平振蕩5 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長570 nm處測定各孔吸光度(A 570)?？鄢尘皩φ盏腁 570值即代表存活細(xì)胞數(shù)量。制作細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞抑制率(IR)。IR=(微缺氧空白組 A570-實(shí)驗(yàn)組A570)/微缺氧空白組A 570×100%。

1.8 細(xì)胞黏附力檢測 用無血清RPMI-16401∶3稀釋matrigel，以20μL/孔加入96孔培養(yǎng)板，成膠后紫外光消毒滅菌后備用，接種細(xì)胞前水化基底膜。取對數(shù)生長期 HT-29細(xì)胞配成濃度為1×105/m L的細(xì)胞懸液，各組均取4 m L接種于培養(yǎng)瓶。微缺氧下培養(yǎng)48 h后，取出各組細(xì)胞，用0.1%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為 5×105/m L，每孔200μL接種于 96孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)。每組細(xì)胞均設(shè)對照，并分為30、60、90、120 min時(shí)段組，每時(shí)段組設(shè)8個(gè)平行孔。于各時(shí)段點(diǎn)吸棄培養(yǎng)液及懸浮細(xì)胞，PBS沖洗除去未黏附的腫瘤細(xì)胞，棄PBS加入 200μL無血清RPMI-1640、20μL MT T培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)上清液，加入二甲亞砜(DMSO)200μL，用酶聯(lián)免疫檢測儀于波長570 nm處測定各孔吸光度(A 570)。細(xì)胞黏附率=實(shí)驗(yàn)組A570值/對照組 A570值×100%。

1.9 明膠酶譜分析 待測細(xì)胞常規(guī)消化后，以106個(gè)細(xì)胞/孔、10%FBS/RPMI-1640接種到6孔板內(nèi)過夜培養(yǎng)。次日用0.01 mmol/LPBS(p H7.4)洗滌后，各組細(xì)胞用無血清RPMI-1640分別在微缺氧下培養(yǎng)24 h，收集其上清液，實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[4]:上清液與 4×上樣緩沖液(62.5 m M Tris-Hcl、p H6.8，10%甘油，2%SDS，0.1%溴酚藍(lán))按照1∶3混合，上樣后在1.5%明膠/8%聚丙烯酰胺凝膠、80 V 20 min、100 V 2 h衡壓電泳。凝膠分別用洗脫液(2.5%T ritonX-100)、孵育液37℃、24 h(50 m M Tris-HCl、p H7.5 ，0.2 M NaCl，5 m M CaCl2，0.02%Triton X-100)，染色緩沖液(0.4%考馬斯亮藍(lán) R-250，10%冰醋酸，20%甲醇)和脫色緩沖液(10%冰醋酸，20%甲醇)至顯現(xiàn)出明顯的蛋白負(fù)染條帶。用Bio-Rad的圖像處理系統(tǒng)對負(fù)染條帶進(jìn)行掃描并定量分析，負(fù)染條帶的大小、亮度反映MMP-2/9的活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以表示，采用方差分析或 t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 OPN m RNA表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，各組均分別在354、764 bp處出現(xiàn)特異性的 OPN基因條帶和內(nèi)參照β-actin條帶。OPN ASODN轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞24 h后，再微缺氧培養(yǎng)24 h，其OPN m RNA的表達(dá)較微缺氧空白組、脂質(zhì)體對照組、SODN組、MODN組下調(diào)68.5%(P＜0.01)，而各對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。

2.2 OPN蛋白表達(dá) ASODN組OPN蛋白表達(dá)較各對照組均明顯下調(diào)(P＜0.01)，表達(dá)量是對照組的35.4%，而各對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2。

2.3 OPN ASODN對微缺氧下HT-29細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，微缺氧下不同時(shí)限點(diǎn)的吸光度值(A 570)及生長抑制率(IR)在各對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而ASODN組的A 570值及IR與各對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，IR為(41.6±1.2)%，各組的生長曲線見圖3。

2.4 OPN ASODN對微缺氧后HT-29細(xì)胞黏附力的影響與微缺氧空白組、脂質(zhì)體對照組、SODN組、MODN組比較，ASODN組HT-29細(xì)胞在各時(shí)限點(diǎn)的黏附率均明顯下降(P＜0.01)，而各對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，各組細(xì)胞在不同時(shí)限點(diǎn)的黏附曲線見圖4。

圖1 RT-PCR檢測OPN ASODN對微缺氧下HT-29細(xì)胞OPN m RNA表達(dá)的影響

圖2 Western blot檢測OPN ASODN對微缺氧下HT-29細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)的影響

圖3 微缺氧下ASODN組與各對照組HT-29細(xì)胞的生長曲線

2.5 MMP-2/9活性 明膠酶譜分析呈現(xiàn)相對分子質(zhì)量為66/72 k D的MM P-2及其前體、92 k D的MMP-9溶解明膠后的負(fù)染條帶，尤以前者為著。與各對照組比較，ASODN組HT-29細(xì)胞分泌的MMP-2/9活性下調(diào)71%(P＜0.01)，而各對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖 5。

圖4 微缺氧后ASODN組與對照組HT-29細(xì)胞的黏附曲線

圖5 微缺氧下ASODN組與各對照組的明膠酶譜

3 討 論

腫瘤組織的氧分壓為0～20 mm Hg，而正常組織則為 40 mm Hg以上，缺氧乃實(shí)體腫瘤物理微環(huán)境的基本特征[5]。適度缺氧可能是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遺傳不穩(wěn)定、惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的始動因素，缺氧介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞惡性篩選，對凋亡不敏感的、在缺氧環(huán)境下生存下來的細(xì)胞更富有侵襲性和對放、化療的抗拒性[6]。作者在前期的研究中將培養(yǎng)液PO220 mm Hg作為微缺氧環(huán)境，檢測到H T-29細(xì)胞在微缺氧下OPN特異性的表達(dá)上調(diào)，且HT-29細(xì)胞異質(zhì)性黏附能力、侵襲游走能力顯著增強(qiáng)，MM P-2/9活性上調(diào)而向惡性表型轉(zhuǎn)化[7]。

在設(shè)計(jì)ASODN的軟件中，Mfold軟件可以識別基因序列中呈環(huán)狀或發(fā)夾狀的區(qū)域，選擇單直鏈的區(qū)域作為靶點(diǎn)，由其設(shè)計(jì)的ASODN更容易與目的基因結(jié)合，基因的抑制效率更高。Adw an等[3]使用該軟件，設(shè)計(jì)合成了10條靶向OPN的ASODN，并篩選出最有效率的 1條，該條 ASODN可以使OPN蛋白表達(dá)下調(diào)84%。作者參照Adwan設(shè)計(jì)的此條序列，合成ASODN，并參照其濃度用Lipofectamine將其轉(zhuǎn)染入微缺氧下高表達(dá)OPN的HT-29細(xì)胞，用RT-PCR和Western Blot分析，結(jié)果顯示 ASODN組OPN m RNA、蛋白表達(dá)較各對照組分別下調(diào)68.5%和64.6%。表明靶向OPN的ASODN能特異、有效地抑制微缺氧下H T-29細(xì)胞OPN m RNA和蛋白的表達(dá)。OPN在多種腫瘤組織中高表達(dá)，它可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的異質(zhì)性黏附，促進(jìn)其移行，并通過與整合素受體、CD44受體結(jié)合而參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞無限制增殖，被認(rèn)為是惡性轉(zhuǎn)化的分泌性蛋白[8]。

Liu等[9]報(bào)道骨肉瘤(OS)中過度表達(dá)的OPN可上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白A(Cyclin A)的表達(dá)，進(jìn)而加速細(xì)胞分裂周期，促進(jìn)OS細(xì)胞的增殖。Muramatsu等[10]將OPN的反義寡核苷酸(AS)轉(zhuǎn)染至高表達(dá)OPN的口腔腫瘤細(xì)胞株BSF-OF，AS組的腫瘤細(xì)胞生長速度較對照組明顯減慢，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力也顯著降低。本實(shí)驗(yàn)表明，ASODN組HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染OPN ASODN后，隨著OPN的下調(diào)，其A 570值明顯低于各對照組，微缺氧下的高增殖活性受到明顯抑制，IR達(dá)(41.6±1.2)%。表明靶向OPN的ASODN對微缺氧下HT-29細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，同時(shí)也提示微缺氧誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞高增殖活性與OPN的上調(diào)密切相關(guān)。

腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一個(gè)主動的過程，在進(jìn)入和離開轉(zhuǎn)移通道時(shí)都需要腫瘤細(xì)胞具備選擇性黏附和主動移行的能力。當(dāng)OPN的RGD序列與整合素受體αvβ3或CD44突變體識別結(jié)合后，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移能力[11]。Moye等[12]將乳腺良性細(xì)胞株Rma通過轉(zhuǎn)染使其表達(dá)OPN，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的黏附力和遷移能力顯著增加，而且該細(xì)胞株可在大鼠體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移灶。丁凌和鄭樹[13]分別構(gòu)建OPN反義和正義真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染入大腸癌細(xì)胞株Colo205和SW480。在高表達(dá)OPN的大腸癌細(xì)胞CD44的表達(dá)也上調(diào)，E-cadherin的表達(dá)則減弱。由此表明，細(xì)胞間同質(zhì)黏附減弱，與ECV304細(xì)胞之間的異質(zhì)黏附增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)用反義寡核苷酸技術(shù)，特異性地封閉微缺氧誘導(dǎo)的OPN，結(jié)果顯示，隨著OPN的下調(diào)，微缺氧誘導(dǎo)的高異質(zhì)性黏附力也明顯降低。表明OPN參與了腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)膜基質(zhì)之間的異質(zhì)性黏附，靶向OPN的ASODN能顯著下調(diào)OPN的表達(dá)，從而減弱微缺氧誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞的異質(zhì)性黏附力。

MMP-2/9活性的高低是評估腫瘤侵襲性的重要指標(biāo)[14]。ASODN組HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染OPN ASODN后，隨著OPN的下調(diào)，其分泌的M MP-2/9活性下調(diào)了71%，表明靶向OPN的ASODN能顯著下調(diào)微缺氧下HT-29細(xì)胞分泌的MMP-2/9活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示，在微缺氧下MMP-2/9是OPN的下游效應(yīng)因子。但MM P-2/9沒有OPN的調(diào)控點(diǎn)，并不直接受OPN的調(diào)控，兩者之間可能還存在某種因子介導(dǎo)。

作者參照Adw an合成靶向OPN的ASODN，用陽性脂質(zhì)體為載體，將其轉(zhuǎn)染至高表達(dá)OPN的微缺氧HT-29細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)靶向OPN的ASODN可明顯抑制微缺氧誘導(dǎo)的OPN m RNA和蛋白表達(dá)，并顯著拮抗微缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、異質(zhì)性黏附，阻抑OPN的表達(dá)，MMP-2/9的活性也隨之下調(diào)，表明OPN在微缺氧促進(jìn)腫瘤向惡性表型轉(zhuǎn)化中起著重要作用。

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