彭禮繁 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物胚胎工程實(shí)驗(yàn)室 110000

激素是促進(jìn)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟的重要物質(zhì)，所以不管用哪種基礎(chǔ)培養(yǎng)液，卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)中激素的添加是必不可少的。為模擬卵母細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育環(huán)境，絕大多數(shù)研究者都在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中添加促性腺激素 （FSH∕LH，PMSG∕hCG）、類(lèi)固醇激素或兩者混合物，也有使用生長(zhǎng)激素（GH）的，但它們?cè)诼涯讣?xì)胞體外成熟過(guò)程中的作用機(jī)理尚未完全清楚。特別是促性腺激素對(duì)成熟的啟動(dòng)發(fā)揮主要作用，一般成熟培養(yǎng)液都要添加。促性腺激素是由腦下垂體后葉、胎盤(pán)和子宮內(nèi)膜分泌的，它包括：卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG）、促乳素和人絨毛膜促性腺激素（hCG）。其中FSH和LH是參與卵母細(xì)胞成熟的最主要蛋白激素，在卵母細(xì)胞體外成熟中使用較多。但它們?cè)诼涯讣?xì)胞體外成熟中的作用及作用機(jī)理尚未完全了解清楚，仍待進(jìn)一步研究。

1 促性腺激素在卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟過(guò)程中的作用

在卵泡發(fā)育的早期缺乏對(duì)促性腺激素的敏感性。盡管近年來(lái)的研究表明，在初級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞上也檢測(cè)到了FSH受體，提示FSH對(duì)卵泡發(fā)育的作用有可能從初級(jí)卵泡就開(kāi)始了，但其作用不強(qiáng)。FSH在卵泡腔的形成中起重要作用。FSH刺激卵泡顆粒細(xì)胞的增生（有絲分裂）及促進(jìn)顆粒細(xì)胞芳香化酶活性，增加雌二醇（E2）的合成和分泌，誘發(fā)卵對(duì)其他激素的敏感性。從而促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟。LH的主要功能是促使成熟卵從卵巢卵泡中釋放。但必須在FSH激素作用之后，并在其他激素輔助下，才能發(fā)揮作用。LH促進(jìn)卵泡內(nèi)膜細(xì)胞合成雌激素前體-雄烯二酮。因此LH與FSH共同促進(jìn)雌激素的合成，增加卵泡細(xì)胞的滲透性，促使它們從血液中吸取代謝所需物質(zhì)，并激發(fā)激素的合成和各種酶的活動(dòng)，最后通過(guò)水解酶的釋放引起卵泡的破裂而造成排卵。

隨著卵泡的發(fā)育，卵泡液中的LH的濃度顯著下降，可能是由于大部分LH與逐步分化的顆粒細(xì)胞結(jié)合所致。在血漿LH峰后的4h，卵泡液中也出現(xiàn)一個(gè)LH峰。一般認(rèn)為，LH是卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的誘導(dǎo)者。因?yàn)榕怕亚奥雅萋涯讣?xì)胞的成熟分裂恢復(fù)與LH峰的時(shí)間基本一致。牛卵泡液中的FSH濃度在卵泡發(fā)育過(guò)程中一直變化不大，直到LH峰后的4h才出現(xiàn)一個(gè)峰，而后逐步下降到20h又再出現(xiàn)一個(gè)峰[1]。

促性腺激素的作用方式可能有以下幾種：①作用于卵泡細(xì)胞，使卵泡細(xì)胞產(chǎn)生孕酮，孕酮再作用于卵母細(xì)胞，參與促成熟因子(MPF)激活；②作用于卵丘細(xì)胞，使卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間的通訊聯(lián)系中斷，使卵丘細(xì)胞產(chǎn)生的環(huán)磷酸腺苷（CAMP）不能進(jìn)入卵母細(xì)胞，致使卵母細(xì)胞內(nèi)的CAMP濃度下降，誘使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂[2]。

2 促性腺激素在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的作用

鑒于促性腺激素在卵泡發(fā)育過(guò)程中的重要作用，F(xiàn)SH和LH被廣泛應(yīng)用于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，但激素對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響一直是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題。一些研究表明，激素能提高卵母細(xì)胞成熟后胚胎的發(fā)育能力，而另一些研究報(bào)道則否定激素有任何作用。這是因?yàn)椴煌芯克捎玫捏w外成熟培養(yǎng)條件不同，并且不同研究中使用激素的純度和確定純度的標(biāo)準(zhǔn)也有所不同所導(dǎo)致的差異。因此，在不同的成熟培養(yǎng)條件下，選擇適合的激素及其適宜的濃度應(yīng)用于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，以達(dá)到最佳的體外成熟效果是完全可行的。

大部分研究中已證實(shí)FSH在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中的重要作用。當(dāng)在成熟液中加入FSH時(shí)，可刺激卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（COCs）中的卵丘細(xì)胞分泌一種促進(jìn)因子，它可抑制由次黃嘌呤造成的分裂阻滯，加速減數(shù)分裂的恢復(fù)。同時(shí)FSH可增加CAMP濃度和卵丘擴(kuò)展[3]。F.Izadyar等的實(shí)驗(yàn)研究了FSH 在牛卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）過(guò)程中核成熟的作用方式，得出在牛卵母細(xì)胞IVM液（TCM-199 HEPES）中使用 hFSH（0.05IU/ml），不僅促進(jìn)核成熟而且提高卵母細(xì)胞受精后的發(fā)育能力，并證明FSH對(duì)IVM作用是通過(guò)CAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的。FSH可增加顆粒細(xì)胞中CAMP的量，在最初可短暫阻滯減數(shù)分裂恢復(fù)，隨后促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，提高受精率和早期胚胎發(fā)育[4]。FSH雖然減慢了減數(shù)分裂的進(jìn)程，但它能促進(jìn)成熟率，這就表明FSH對(duì)胞質(zhì)成熟的作用，在降低核成熟速度同時(shí)促使特定蛋白的合成而促進(jìn)質(zhì)成熟，有利于卵母細(xì)胞體外受精（IVF）過(guò)程中的胚胎發(fā)育[5]。

在卵母細(xì)胞IVM中濃度為0.25-20μg/ml的FSH都有添加。同時(shí)FSH的作用也受到成熟液中其它常規(guī)添加物的限制。Seji Kito等實(shí)驗(yàn)表明在無(wú)血清成熟液（Tyrode's-PVA）來(lái)培養(yǎng)大鼠COCs時(shí)，添加FSH不利于卵母細(xì)胞核成熟。在有血清存在時(shí)，F(xiàn)SH對(duì)IVM核成熟有利，表明促性腺激素對(duì)卵母細(xì)胞成熟影響程度依賴(lài)于成熟液中其他成分如血清、牛血清白蛋白（BSA）等[6]。Y.Z.Bing等實(shí)驗(yàn)中得出在豬COCs成熟液中（m TCM-199）加FSH，隨著FSH濃度增加，生發(fā)泡破裂（GVBD）的發(fā)生率和成熟至MⅡ期的比例也不斷增加。當(dāng)成熟液中存在E2時(shí)，添加1μg/ml的FSH的成熟效果與只添加10μg/ml的FSH的成熟液的成熟效果相似，這說(shuō)明與其他激素聯(lián)合使用時(shí)FSH的濃度可適當(dāng)改變。Atef.Ali等實(shí)驗(yàn)中使用不同來(lái)源的蛋白質(zhì)作為蛋白質(zhì)添加劑添加到牛COCs成熟培養(yǎng)液（SOF）中，結(jié)果表明FSH對(duì)核成熟和卵丘擴(kuò)展的作用依賴(lài)于IVM液中的底物。總之，在大部分實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件都可找到FSH使用的最佳濃度，可促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟。

在卵母細(xì)胞 IVM 中，LH（0.5-100μg/ml）都有添加。對(duì)其在卵母細(xì)胞成熟及隨后胚胎發(fā)育中的作用也說(shuō)法不一。但大部分實(shí)驗(yàn)中都添加LH，并進(jìn)一步研究LH在成熟過(guò)程中的作用方式。Y.H.Choi等認(rèn)為L(zhǎng)H可促進(jìn)COCs中糖酵解和葡萄糖氧化以及LH作用后的成熟裸卵中的谷胺酰胺的氧化。通過(guò)提高牛卵母細(xì)胞IVM過(guò)程中的葡萄糖代謝來(lái)提高胚胎的發(fā)育能力[3]。Kurta.Zuelke等實(shí)驗(yàn)得出，當(dāng)在牛COCs體外成熟液中添加LH可促進(jìn)卵母細(xì)胞受精后的胚胎發(fā)育，但裸卵對(duì)LH無(wú)反應(yīng)，說(shuō)明卵丘細(xì)胞是LH起作用的中間物質(zhì)，還得出在體外成熟時(shí)加入LH可促進(jìn)COCs中糖酵解和線粒體內(nèi)葡萄糖氧化作用，從而LH可能通過(guò)調(diào)整卵母細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境來(lái)促進(jìn)成熟的[7]。

LH的作用同樣也受到成熟液中常規(guī)添加物質(zhì)的影響。在不同的成熟液中添加的劑量也有很大差異。Brackett BG等和Younis AI等實(shí)驗(yàn)得出在牛卵母細(xì)胞IVM液中 （加或不加血清）添加高濃度LH（50 或 100μg/ml）可提高胚胎體外發(fā)育能力[8，9]。Keefer CL等也報(bào)道添加 LH （10，000 IU/ml）可顯著促進(jìn)第一極體形成，提高IVF后的分裂率和囊胚發(fā)育[10]。但Y.H.Choi等實(shí)驗(yàn)得出LH 不能提高在無(wú)血清的IVM液中成熟的卵母細(xì)胞IVF后的胚胎發(fā)育能力，但LH和FSH結(jié)合使用時(shí)可提高牛卵母細(xì)胞IVF后的分裂率，肯定了LH的促成熟作用，并認(rèn)為許多研究結(jié)果的差異是由于培養(yǎng)系統(tǒng)的不同而造成的，以及所使用的LH是否高度純化而決定的[3]?？傊?，由于各研究中所使用的成熟培養(yǎng)系統(tǒng)的不同，以及使用的LH的純化標(biāo)準(zhǔn)的區(qū)別，得出了不同的試驗(yàn)結(jié)果，其添加劑量也由于培養(yǎng)時(shí)其它激素的有無(wú)和劑量而存在很大差別。但在多數(shù)的研究中仍肯定LH的促成熟作用，并在成熟過(guò)程中有所添加。

3 小結(jié)

FSH和LH這兩種激素在卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的過(guò)程中起重要作用，它們?cè)隗w內(nèi)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟的作用機(jī)理也比較清楚。因此，這兩種激素在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)也最常用。但它們的應(yīng)用效果和應(yīng)用劑量一直存在較大爭(zhēng)議。在不同的研究中得出的結(jié)果差別較大，使用的劑量差別也很懸殊。但大部分實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)了促性腺激素（FSH，LH）對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟中的重要作用。由于不同的研究所使用的體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)不同，以及使用激素的純度也存在差別，所以就造成了培養(yǎng)的不同效果。所以根據(jù)不同的體外成熟培養(yǎng)條件，選擇適合的激素及其適宜的濃度應(yīng)用于卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，以達(dá)到最佳的體外成熟效果是完全可行的。

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