崔國棟

(呂梁山國有林管理局車鳴峪林場,山西 中陽 033400)

1 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(Cell suspension culture)是指將植物細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)懸浮于液體培養(yǎng)基中,并使細(xì)胞保持在良好分散狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù),即植物細(xì)胞生長的微生物化[1]。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)不僅可直接用于原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)與雜交,基因轉(zhuǎn)移和生產(chǎn)次生代謝物等,還可短期內(nèi)在細(xì)胞水平篩選出預(yù)期突變體。因此,細(xì)胞懸浮培養(yǎng)已成為植物生物技術(shù)中最有用的手段之一[1,2]。

2 林木懸浮系建立過程中的影響因素

2.1 培養(yǎng)材料

2.1.1 外植體和基因型

外植體(胚性愈傷組織)來源和狀態(tài)對細(xì)胞懸浮系的質(zhì)量及單細(xì)胞的再生能力均有一定影響。建立軟棗獼猴桃(Actinidia arguta)懸浮細(xì)胞系時,發(fā)現(xiàn)隨著生長期的增加,褐化發(fā)生的時間越短,褐化越嚴(yán)重,并且活細(xì)胞率也越低,畸形細(xì)胞增多[3]。植物懸浮細(xì)胞系的建立對基因型的依賴是普遍存在的難題,有研究表明,在龍眼 (Dimocarpus longan)懸浮植株再生的研究中,3種龍眼的各懸浮參數(shù)不同[4]。

2.1.2 愈傷組織類型

懸浮細(xì)胞系的建立通常是以生長快、易散碎的松散胚性愈傷組織為起始材料,對于培養(yǎng)難度較大的木本植物來說,建立懸浮細(xì)胞系成功的關(guān)鍵在于松散、易碎的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和胚性保持[5,6]。胚性愈傷組織的類型一般可分為兩種:1)質(zhì)地堅(jiān)硬、塊狀、顏色淺黃且表面有光澤的胚性愈傷組織。2)質(zhì)地疏松、易分散、不分泌黏液、顆粒狀且表面有光澤的胚性愈傷組織。其中第 2類胚性愈傷組織適合懸浮培養(yǎng),建立的懸浮細(xì)胞系生長旺盛,細(xì)胞內(nèi)含物充實(shí)。因此,每次繼代培養(yǎng)時,應(yīng)挑選第 2類愈傷組織作為培養(yǎng)材料[7,8]。

2.1.3 培養(yǎng)材料的褐化

褐化在植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中普遍存在,其能否得到有效的控制是植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵所在[9,10]。導(dǎo)致褐化的因素較多,如基因型、附加物、基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等。不同的激素對愈傷組織和細(xì)胞的作用是不一樣的,因此,對愈傷組織和細(xì)胞褐化的影響也不同。常用于胚性愈傷組織誘導(dǎo)和保持及增殖培養(yǎng)的抑制褐化附加劑有:硫代硫酸鈉 (Na2S2O3)、檸檬酸 (CA)、半胱氨酸 (Cys)、維生素 C(Vc)、脫落酸(ABA)、二硫蘇糖醇 (DTT)、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、活性碳 (AC)、硝酸銀(AgNO3)、植酸 (PA)、水解酪蛋白 (CH)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)等,不同的抗褐化劑對愈傷組織和細(xì)胞褐化的抑制作用是不同的[11]。在紅豆杉(Taxus chinensis var.mairei)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中,1 000 mg/L活性碳,600 mg/L水解酪蛋白,100 mg/L植酸能完全控制褐化,而硫代硫酸鈉、檸檬酸、半胱氨酸、維生素 C、脫落酸不能有效地控制其褐化[12]。

2.2 培養(yǎng)基成分

2.2.1 基本培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中大量元素的濃度對懸浮培養(yǎng)愈傷組織細(xì)胞存活率有較大影響。研究表明,當(dāng)培養(yǎng)基中大量元素總濃度過高時,枸杞(Lycium bararum)懸浮系中活細(xì)胞百分率降低,還可看到許多細(xì)胞呈皺縮狀態(tài),這說明培養(yǎng)液滲透壓過高[13]。在建立印楝(Azadirachta indica)懸浮細(xì)胞系過程中也發(fā)現(xiàn),B5較 M S對懸浮系的建立更為有效,接種在 MS培養(yǎng)基上的愈傷組織懸浮起來較困難,并且生長緩慢,在繼代過程中容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象;而接種到 B5培養(yǎng)基上的愈傷組織,很容易懸浮起來,繼代 3次即可建立比較均勻的懸浮培養(yǎng)系,生長迅速,并且在繼代培養(yǎng)過程中沒有出現(xiàn)褐化現(xiàn)象[14]。

2.2.2 植物激素

在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時,需要添加適當(dāng)比例的植物激素,才能保持胚性細(xì)胞的分裂,但是激素的絕對量也是很重要的,不同的植物種類需要的激素種類也是不一樣的。雷公藤(Tripterygium wilfordii)愈傷組織在含 2,4-D的培養(yǎng)液中細(xì)胞生長最慢,干物質(zhì)產(chǎn)量最低;在含 IAA的培養(yǎng)液中,細(xì)胞生長速度和干物質(zhì)產(chǎn)量中等;在含 NAA的培養(yǎng)液中生長最快,每升培養(yǎng)基上收獲的干物質(zhì)產(chǎn)量最大[15]。高桂珍等在研究不同化學(xué)因子對喜樹(Camptotheca acuminata)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長效應(yīng)時發(fā)現(xiàn),單因子以NAA效果最好,其中NAA最佳濃度為 0.5 mg/L;組合因子比單因子更有利于細(xì)胞的生長,以0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L KT的效果最佳[16]。

2.2.3 有機(jī)附加物

木本植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)以無機(jī)氮為主,有時輔以有機(jī)氮源,氨基酸是常用的有機(jī)氮源之一[17,18],加入氨基酸一方面可以為植物細(xì)胞提供氮源,另一方面可為細(xì)胞代謝提供中間產(chǎn)物。許多天然有機(jī)物或其制成品也可加入植物培養(yǎng)基中,而且比加入某種單一的氨基酸更好。水解酪蛋白能顯著提高南方紅豆衫[19](Taxus chinensis var.mairei)和葡萄[20](Vitis vinifera)懸浮細(xì)胞的生長速率和細(xì)胞培養(yǎng)密度。肌醇能促進(jìn)龍眼胚性懸浮細(xì)胞分化,延緩懸浮細(xì)胞衰老[4]。不同濃度的肌醇對半夏(Pinellia ternata)懸浮細(xì)胞生長影響不大,但濃度過高可抑制細(xì)胞的增殖[21]。糖類物質(zhì)是植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的碳源和能源,同時又是維持細(xì)胞生長所需滲透壓的滲透壓穩(wěn)定劑[22]。研究發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中的蔗糖濃度由 2%增加到 3%時,黃連懸浮細(xì)胞生長有明顯加快,但蔗糖濃度在 3%～6%范圍內(nèi),收獲物的干重、細(xì)胞生長速率未有明顯變化;當(dāng)蔗糖濃度為 7%時,生長速率開始下降,說明 3% 的蔗糖濃度適合黃連細(xì)胞生長,這與細(xì)胞生長受到抑制和部分細(xì)胞褐變死亡有關(guān)[23]。

2.3 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式

2.3.1 培養(yǎng)起始密度

木本植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時,起始密度對懸浮細(xì)胞生長影響較大。如白木千(Picea meyeri)細(xì)胞胚懸浮培養(yǎng)時,接種量為 3.0%,細(xì)胞增殖的延遲期縮短,很快進(jìn)入對數(shù)生長期,胚性愈傷組織生長率為182%,培養(yǎng) 9 d后達(dá)到最大值 8.46 g/100 mL[24]。因此,植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時必須達(dá)到最低有效密度。當(dāng)接種密度過大時,一方面需要大量材料,另一方面培養(yǎng)液中的養(yǎng)分很快被消耗殆盡。只有起始接種量與營養(yǎng)物比例適合,才能達(dá)到最好的培養(yǎng)效果,既可充分利用營養(yǎng)物,又可提高懸浮細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)。

2.3.2 新舊培養(yǎng)液比例與轉(zhuǎn)速

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞能分泌某些促進(jìn)細(xì)胞分裂的物質(zhì),因而舊培養(yǎng)液中含有這些物質(zhì)。向新鮮培養(yǎng)基中加入舊懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液,可促進(jìn)繼代細(xì)胞分裂[25]。換液時,保留培養(yǎng)液比例是很重要的,舊培養(yǎng)基太少(小于總培養(yǎng)基的 1/10),細(xì)胞不能生長,并且容易褐化死亡;舊培養(yǎng)基比例大時,細(xì)胞又容易變得不致密,易呈饑餓態(tài)[23,25]。

由于植物細(xì)胞比細(xì)菌或真菌細(xì)胞大 10倍～100倍,在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中,搖床轉(zhuǎn)速過高易產(chǎn)生對細(xì)胞傷害的剪切力;轉(zhuǎn)速過低,不但細(xì)胞易成團(tuán),且易堆積,造成營養(yǎng)死角,使細(xì)胞得不到充足的營養(yǎng),最后衰老死亡,且轉(zhuǎn)速低使瓶內(nèi)溶氧量減少,不利于細(xì)胞生長[26]。植物細(xì)胞對剪切力的敏感性要高于微生物,一般轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在 90 r/min～120 r/min。

3 結(jié)語

影響木本植物懸浮培養(yǎng)的因素主要有以上 3個方面,具體到某一種木本植物進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時要根據(jù)培養(yǎng)材料的具體表現(xiàn)調(diào)整培養(yǎng)條件,最終目標(biāo)是操作簡便、懸浮系優(yōu)良。建立完善的樹木細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系,不僅是生產(chǎn)樹木有用次生代謝產(chǎn)物、發(fā)展樹木經(jīng)濟(jì)價值的有效途徑,而且是實(shí)現(xiàn)樹木遠(yuǎn)緣雜交的基礎(chǔ)性體系。隨著各項(xiàng)科學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展,我們將會發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系在林業(yè)發(fā)展中具有更重要的作用。

[1]路鐵剛,葉和春.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞工程試驗(yàn)技術(shù) [M].北京:科學(xué)出版社 ,1995:36-47.

[2]Moham Ram H Y.The induction of growth in explanted tissue of banana fruit[J].Canada Journal Botany,1984,42:1 559-1 579.

[3]賴鐘雄,陳振光.龍眼胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)再生植株[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2002,8(5):485-491.

[4]陳振光.園藝植物離體培養(yǎng)學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995:31-61.

[5]Dhed A D,Dumortier F,Panis B,et al.Plant regeneration in cell suspension cultures of the cooking banana cv[J].(Musa spp.ABB group),Fruits.1991,46(2):125-135.

[6]楊遠(yuǎn)媛,賀窯青,鄭彩霞.油松胚珠愈傷組織誘導(dǎo)和懸浮細(xì)胞系的建立 [J].植物生理學(xué)通訊,2005,41(5):591-594.

[7]路鐵剛,葉和春.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞工程試驗(yàn)技術(shù) [M].北京:科學(xué)出版社 ,1995:36-47.

[8]孔祥生,張妙霞,杜愛玲,等.甜柿離體快繁技術(shù)研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,17(2):178-186.

[9]Debergh P C,Zimmerman R H.Micxopro pagation[M].Kluwer Academic Publisher,1991:5-13.

[10]鄒英寧,李國懷,樊青峰,等.不同抗氧化劑對中國李莖段培養(yǎng)的影響 [J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,25(1):84-86.

[11]黃 浩,魯明波,梅興國 .紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中抗褐變劑的篩選 [J].華中理工大學(xué)學(xué)報,1999,27(4):107-109.

[12]張國柱,王侖山 ,潘有福,等.植物體細(xì)胞胚發(fā)生的同步控制:I,枸杞細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立[J].蘭州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,1994,30(4):88-91.

[13]梁 軍,魏 剛,呂 全 .印楝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立及懸浮培養(yǎng)[J].林業(yè)科學(xué)研究,2003,16(5):568-574.

[14]毛堂芬,顏 謙,方周伯 .蔗糖和硝酸銨對黃連懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和小檗堿含量的影響[J].生物技術(shù),1994,23(3):99-102.

[15]高桂珍,周吉源,秦 凡 .不同化學(xué)因子對喜樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長效應(yīng)的研究 [J].生物技術(shù),2003,13(3):35-40.

[16]Behrend J,Riechard J M.Nitrogen metabolism in plant cell suspension cultures:effect of amino acids on growth[J].Plant physiology,1975,5(6):584-589.

[17]齊力旺.華北落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生和遺傳轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)的建立的研究[D].北京:中國林業(yè)科學(xué)研究院,2000:44-46.

[18]胡 萍,李淑穎 ,元英進(jìn),等.南方紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件優(yōu)化研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1997,11(4):30-35.

[19]Chen J X,Hall D E,Murata,et al.Lalanine induces programmed cell death in V.labrusca cell suspension cultures.Plant Science,2006,171(6):734-744.

[20]范美華,馮玲玲,彭 瑜 .幾種營養(yǎng)因子對半夏懸浮細(xì)胞生長及總生物堿形成的影響[J].華中師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2004,38(4):283-286.

[21]邱曉芳.杜仲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及主要次生代謝產(chǎn)物積累研究 [D].江西:江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2007:30-35.

[22]曹 宗.植物生理學(xué) (下冊)[M].北京:高等教育出版社,1980:278.

[23]楊金玲,桂耀林,郭仲琛 .白木千細(xì)胞胚懸浮培養(yǎng)的動力學(xué)研究 [J].生物工程學(xué)報,2000,16(2):219-222.

[24]朱至清.植物細(xì)胞工程[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003:25-26.

[25]劉春朝,王玉春,鄭 重,等.剪切力對植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響[J].化工冶金,1998,19(4):380-384.

[26]李 春,李 娟 ,沈慧慧,等.肉蓯蓉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的代謝動力學(xué)研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2007,19:193-197.