田泱源 李瑞芳

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

糧食微生物檢測技術(shù)與防制措施*

田泱源**李瑞芳

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

對目前最新檢測和鑒定糧食微生物的方法及原理、糧食微生物防制措施進(jìn)行總結(jié)，以期為糧食儲藏提供指導(dǎo)。

糧食微生物；微生物檢測；防制措施

糧食微生物是指寄附在糧食和食品上的微生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌類中的真細(xì)菌和放線菌，真菌類中的霉菌、酵母菌以及病毒等，這些微生物寄附在糧食及其制品的表面和內(nèi)部。糧食中含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，一旦條件合適，微生物就會通過分泌水解酶，將糧食中的營養(yǎng)物質(zhì)分解，破壞糧食的組織結(jié)構(gòu)，甚至?xí)诩Z食中產(chǎn)生具有強(qiáng)烈毒性和致癌性的毒素，引起糧食產(chǎn)后嚴(yán)重?fù)p失。因此了解當(dāng)前糧食微生物監(jiān)測體系和防制措施，對有效減少糧食產(chǎn)后損失是十分必要的。

1 糧食微生物檢測技術(shù)

糧食微生物檢測包括定量和定性兩個方面，定量是指糧食中微生物的數(shù)量測定；而定性是根據(jù)微生物表現(xiàn)的各種性狀特征，對微生物的種類進(jìn)行鑒別。

傳統(tǒng)的檢測技術(shù)主要以分離純化培養(yǎng)為基礎(chǔ)，在細(xì)胞水平上從形態(tài)特征、生化反應(yīng)等方面鑒別微生物；新的檢測技術(shù)包括分子生物學(xué)技術(shù)、免疫技術(shù)、代謝技術(shù)、氣相色譜等技術(shù)，使糧食微生物檢測技術(shù)向快速、靈敏、特異的方向發(fā)展。

1.1 傳統(tǒng)的檢測方法

1.1.1 糧食微生物的分離培養(yǎng)和接種鑒定技術(shù)

這是微生物檢測鑒定最常用的技術(shù)之一，他利用微生物群體特征進(jìn)行檢測鑒定。尤其對于形態(tài)相對較復(fù)雜的霉菌，往往有一些區(qū)別于其他種類的突出特征，一般可以借助形態(tài)特征進(jìn)行種群鑒定。

由于其簡便易行，對設(shè)備要求不高，因此分離培養(yǎng)技術(shù)是最常用的技術(shù)，但其最大的缺點(diǎn)就是需要的周期比較長，檢測的結(jié)果具有不準(zhǔn)確性。

1.1.2 電子顯微鏡檢測技術(shù)

電子顯微鏡又分透射電鏡和掃描電鏡，透射電鏡多用于糧食微生物形態(tài)的觀察，掃描電鏡主要用于細(xì)菌和真菌孢子表面形態(tài)特征觀察。但是這些技術(shù)都需要昂貴的設(shè)備，廣泛應(yīng)用尚有難度。

1.2 分子生物學(xué)技術(shù)

1.2.1 DNA探針技術(shù)

DNA探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對的高度精確性，對某一特異性DNA序列進(jìn)行探查的新技術(shù)。應(yīng)用不同病原微生物的DNA探針，進(jìn)行相應(yīng)病原微生物的檢測。如Chen JC等將食品病原菌Listeria monocytogenes的特異DNA序列經(jīng)過熒光標(biāo)記后作為探針，檢測Listeria monocytogenes病原菌，而其他李斯特菌種不能被檢測，因此，避免了其他菌對結(jié)果的干擾。目前，DNA探針技術(shù)已經(jīng)在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒等檢測中得到了應(yīng)用。但是采用DNA探針技術(shù)檢測微生物無法區(qū)別糧食中的死菌和活菌，得到的結(jié)果對糧食微生物堆集程度的判斷會有一定的偏差。

1.2.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR的基本原理是在體外對特定的雙鏈DNA片段進(jìn)行高效擴(kuò)增，故又稱基因體外擴(kuò)增法。利用PCR精確、微量的優(yōu)點(diǎn)對某些微生物特異基因進(jìn)行擴(kuò)增，以確定糧食中是否受到這些微生物的污染?，F(xiàn)在廣泛利用的有反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction，RT-PCR） 和熒光定量PCR等。RT-PCR是利用信使RNA（mRNA） 為模板，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶，在4種dNTP存在條件下，合成出DNA鏈，并利用DNA聚合酶將其進(jìn)一步大量擴(kuò)增的技術(shù)。相對于PCR技術(shù)只能檢測病原菌染色體來說，RT-PCR檢測的是病原菌的mRNA，即檢測活菌的存在。熒光定量PCR又稱實時定量PCR（Real-Time PCR），是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累來實時監(jiān)測整個PCR過程和PCR產(chǎn)物的量，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光PCR技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR相比，可檢測mRNA含量水平，由此可判斷出特定基因的轉(zhuǎn)錄水平。

D'Souza DH等利用熒光定量RT-PCR檢測沙門氏菌侵襲宿主相關(guān)基因invA的mRNA水平，判斷食品中致病性沙門氏菌活菌的存在及其侵染能力。蔣魯巖等為同時測定糧食中的副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌，建立了基于TaqMan探針的雙重Real-time（實時）PCR方法。該方法對2種細(xì)菌菌液的檢測敏感度均低于10 cfu/PCR反應(yīng)體系，相關(guān)系數(shù)均為1.00，整個試驗可在2 h內(nèi)完成。

1.2.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過掃描儀定量分析熒光分布模式，來確定檢測樣品中是否存在某些特異微生物?；蛐酒夹g(shù)理論上可以在一次實驗中檢出所有潛在的致病菌，也可以用同一張芯片檢測某一致病菌的各種遺傳學(xué)指標(biāo)。

基因芯片技術(shù)需要特殊的檢測設(shè)備，易污染，這也降低了他在實際工作中的應(yīng)用，因此又構(gòu)建了一種新的納米金基因芯片。直徑為納米范圍的金顆?；蚝鸬幕衔铮哂辛己玫纳锛嫒菪?，對其進(jìn)行修飾后就能標(biāo)記到特定的核酸上，作為信號報告分子使用，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且與銀反應(yīng)后可形成比原來體積大106倍的黑色顆粒，可以用肉眼觀察或用普通裝置記錄。因此，納米金基因芯片技術(shù)大大提高了基因芯片的靈敏度和適用性。

1.3 免疫技術(shù)

1.3.1 乳膠凝集反應(yīng)

乳膠凝集反應(yīng)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性，加上人工大分子的乳膠顆粒，發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。用該方法制成的試劑盒檢測金黃色葡萄球菌，1 min就可以發(fā)生凝集反應(yīng)。該方法實驗設(shè)備要求低、靈敏度和特異性均較高，適用于定性檢測。

1.3.2 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

ELISA是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，既可測抗原，也可測抗體。ELISA用固相載體吸附抗體（抗原），加待測抗原（抗體），再與相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體（抗原）進(jìn)行抗原抗體的特異免疫反應(yīng)，生成抗體（抗原） -待測抗原（抗體） -酶標(biāo)記抗體（抗原）的復(fù)合物，最后再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物，通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測物質(zhì)含量。陳福生等以曲霉特異性抗體為材料，運(yùn)用酶聯(lián)免疫法對幾種糧食曲霉的多糖進(jìn)行檢測，并和平板計數(shù)法的曲霉菌落數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明兩者有很好的線性關(guān)系。該方法實驗設(shè)備要求低，靈敏度和特異性均較高，可進(jìn)行定性和定量檢測。

1.3.3 免疫磁性微球

免疫磁性分離方法，是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病微生物發(fā)生特異性結(jié)合，載有致病微生物的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病微生物不但得到分離，而且也得到濃集，達(dá)到了檢測和鑒定微生物的目的。劉琳琳利用免疫磁性微球1h內(nèi)就可以分離檢測出金黃色葡萄球菌和鏈球菌，且穩(wěn)定性好，成本低，可以在微生物檢測方面得到廣泛的應(yīng)用。

1.4 代謝技術(shù)

代謝技術(shù)主要包括生物發(fā)光技術(shù)、電阻抗技術(shù)、放射測量技術(shù)、微熱量技術(shù)。這些技術(shù)都是通過測量微生物新陳代謝過程中一些特殊現(xiàn)象和物理量的變化來檢測微生物的含量。生物發(fā)光技術(shù)利用ATP是熒光素酶發(fā)光的必需底物且呈線性關(guān)系來測定ATP的含量，而微生物的特定生長時期其ATP含量恒定，因此可以通過發(fā)光強(qiáng)度來確定微生物的含量。電阻抗技術(shù)的原理是細(xì)菌在生長繁殖的過程中會將大分子電惰性物質(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)分解為小分子具有電活性的物質(zhì)，我們可以通過檢測電阻抗的變化來判定細(xì)菌的生長繁殖特性。放射測量技術(shù)是通過測定引入的放射性14C標(biāo)記來判斷細(xì)菌的數(shù)量。微熱量技術(shù)是通過測定細(xì)菌生長時熱量的變化進(jìn)行細(xì)菌的檢出和鑒別。

1.5 氣相色譜技術(shù)

氣相色譜法是英國生物學(xué)家Martin等人于1952年創(chuàng)立的一種物理及物理化學(xué)的分離分析方法。他是一種以氣體為流動相，采用沖洗法的柱色譜分離技術(shù)，并與適當(dāng)?shù)蔫b定手段相結(jié)合的一種分離分析方法。其特點(diǎn)是高選擇性、高分離效能、高靈敏度、高速度以及應(yīng)用范圍廣。采用氣相色譜法可以通過分析細(xì)菌的細(xì)胞成分、體外培養(yǎng)的代謝物等來檢測和鑒定微生物。

Schmidt H等采用氣相色譜對大腸桿菌、藤黃微球菌和巨大芽孢桿菌進(jìn)行檢測，試驗結(jié)果顯示，在保留時間1.5 min～28 min內(nèi)，每種菌都有15種特定物質(zhì)，這些物質(zhì)的峰大多分布在這段保留時間內(nèi)，但大約有一半大腸桿菌裂解產(chǎn)物的峰保留時間大于20 min。根據(jù)細(xì)菌裂解產(chǎn)物的圖譜分析，即可進(jìn)行菌種鑒定。Maddula S等利用氣相色譜技術(shù)測量細(xì)菌分泌的易揮發(fā)性代謝物的量來確定大腸桿菌的數(shù)量。

1.6 毛細(xì)管電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳是泛指以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道。依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現(xiàn)分離的一類分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳與傳統(tǒng)的平板電泳方法相比，具有分離柱效高、分析速度快、自動化程度高、分析對象廣、分離模式多等特點(diǎn)。毛細(xì)管電泳已廣泛應(yīng)用于食品微生物的分析檢測中，與氣相色譜方法相比，具有樣品前處理相對簡單、無需提取物和方法發(fā)展相對快等優(yōu)勢。

毛細(xì)管電泳技術(shù)能將細(xì)菌當(dāng)作“離子”看待。細(xì)菌在一定的生理條件下，其表面基團(tuán)的電離狀態(tài)和雙電層的厚度是電泳緩沖液種類、pH值、離子強(qiáng)度和溫度等參數(shù)的函數(shù)，可以通過優(yōu)化這些參數(shù)分離不同種類的細(xì)菌。毛細(xì)管電泳理論指出，分離柱效隨樣品分子擴(kuò)散系數(shù)或分子量的增大而上升，這就預(yù)示著毛細(xì)管電泳在細(xì)胞分離中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。Law SW等利用毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測食品中的大腸桿菌，比其他的方法均節(jié)約時間。

1.7 微生物自動檢測儀

隨著微生物快速檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，很多檢測技術(shù)日趨成熟和完善，并被人們進(jìn)一步開發(fā)研制成自動或半自動微生物檢測儀。比如最新研制的霉菌快速檢測裝置就可以檢測糧食中微生物數(shù)量的變化。其基本原理是當(dāng)霉菌等微生物在糧食中活動時，隨著微生物數(shù)量的增加，酶的活性將提高，利用新研制的檢測儀可以檢測糧食樣品中酶活性的變化，即可快速檢測和判斷出糧食中微生物活動的狀況。而且研究表明，儀器檢測結(jié)果與糧食中實際微生物數(shù)量變化具有很強(qiáng)的線性相關(guān)。檢測儀最大的優(yōu)點(diǎn)是可以避免死菌對于結(jié)果的影響，因為死菌是不能產(chǎn)酶的，而酶活力與微生物的數(shù)量是顯著相關(guān)的，所以儀器檢測的結(jié)果與儲藏糧食中的實際微生物數(shù)量變化具有很強(qiáng)的線性相關(guān)性。利用儀器檢測的缺點(diǎn)是無法分辨微生物的種類。

2 糧食微生物的防制措施

糧食發(fā)生霉變，不僅影響糧食容重（即糧食所含的能量），而且嚴(yán)重地影響糧食的品質(zhì)，甚至使糧食喪失食用價值，因此預(yù)防糧食微生物引起的損失主要是防止糧食發(fā)生霉變。防止霉變的措施主要有：

2.1 控制環(huán)境溫度

環(huán)境溫度對霉菌的生長、繁殖及存活有著極為重要的作用。各種霉菌均有其最適宜生長發(fā)育的溫度范圍，在此溫度下霉菌代謝強(qiáng)度高、生長旺盛、繁殖迅速。當(dāng)超過最低或最高溫度界限時，其代謝便會受到抑制，以致停止生長或死亡。如曲霉生長最適溫度一般在30℃左右。一般說來，糧溫在20℃～40℃是大多數(shù)微生物生長的適宜溫度；當(dāng)溫度為5℃～15℃，則生長發(fā)育緩慢，甚至停滯。因此控制糧堆溫度是防霉的重要措施之一?？刂茰囟仁潜容^容易實現(xiàn)的一種預(yù)防措施，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。

2.2 控制環(huán)境水分

儲糧環(huán)境中水分條件包括大氣、倉房和糧堆的相對濕度、糧食含水量或水活度（AW）。水分是生物細(xì)胞的主要成分之一，微生物的新陳代謝必需有水的參加。水分是微生物生長繁殖的基本條件，各種微生物生長的最低水活度（AW）為：一般細(xì)菌0.90；一般酵母0.88；一般霉菌0.80；一些干生性霉菌0.65。糧食上曲霉屬霉菌孢子萌發(fā)最低AW值為0.65～0.78；青霉屬霉菌為0.79～0.81。一般說來、糧食水分降至13%以下AW為0.65，才能完全抑制霉菌的活動。因此可以通過控制環(huán)境的水分來抑制霉菌的生長繁殖。

2.3 氣體成分

絕大多數(shù)霉菌是好氧的，在低氧環(huán)境下霉菌生長速度大為減弱。要達(dá)到完全抑制霉菌生長，糧堆氧體積分?jǐn)?shù)必須控制在0.2%左右。有人研究當(dāng)糧堆CO2體積分?jǐn)?shù)達(dá)40%以上時，對一些霉菌的發(fā)育有抑制作用，在體積分?jǐn)?shù)80%的CO2氣體中，白曲霉、黃曲霉、黑曲霉、雜色曲霉和青霉的生長可完全抑制，而且也可抑制一些酵母菌的生長。

因此可以人為地排除糧堆中原有氣體，引入某些惰性氣體如CO2、N2以及這些氣體的混合物，使得糧堆內(nèi)氧含量降低，霉菌在低氧或絕氧情況下就會停止生長或受到抑制。在國外，氣調(diào)儲藏已作為現(xiàn)代儲糧的一種重要方法。

3 展望

民以食為天，食以安為先。面臨嚴(yán)峻的糧食安全問題，快速、有效的微生物檢測技術(shù)和方法是解決這一問題的關(guān)鍵。目前的糧食微生物檢測技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，如有的技術(shù)經(jīng)濟(jì)適用，但是耗時太長，使用受到限制；有的技術(shù)靈敏度高、特異性好、方便快捷，但由于需要精密昂貴的儀器和專業(yè)技術(shù)，目前不能普及應(yīng)用。目前，國外多應(yīng)用氣相色譜、液相色譜、毛細(xì)管電泳等技術(shù)檢測糧食微生物。這些技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，但由于所需儀器設(shè)備昂貴，在國內(nèi)應(yīng)用較少。因此，尋找新的方便、快捷并可廣泛應(yīng)用的檢測方法仍是研究的熱點(diǎn)。

目前，雖然已能通過降低水分含量、補(bǔ)充惰性氣體和控制環(huán)境溫度來實現(xiàn)固定儲糧糧倉微生物的控制。但在糧食進(jìn)出口和運(yùn)輸過程中，火車、汽車、輪船等運(yùn)輸工具由于缺少相應(yīng)的技術(shù)設(shè)備，糧食霉變嚴(yán)重。因此，加強(qiáng)糧食運(yùn)輸過程中簡易防霉技術(shù)的研究仍具有重要意義。

［1］蔣志國，杜琪珍.食品病原微生物快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā) 2008，29（3）：165-170.

［2］CHEN J C，BROSCH R，LUCHANSKY B J.Isolation and characterization of Listerla monocyto genes specific nucleotidesequences［J］.Applied and EnviromentalMicrobiology.1993，59（12）：4 367.

［3］D'SOUZA H D，CRITZER J F，GOLDEN A D.Real-Time reverse-transcriptase polymerase chain reaction for the rapid detection of Salmonella using invA primers［J］.Foodborne Pathogensand Disease.2009，6（9）：1-10.

［4］蔣魯巖，蔡潭溪，邵景東，等.應(yīng)用雙重Real-time PCR同步定量檢測食品中的副溶血性弧菌及金黃色葡萄球菌［J］.中國食品衛(wèi)生，2006，18（3）：205-209.

［5］韓熹，朱莉莎，姚建垣.實時熒光定量PCR分析技術(shù)的應(yīng)用［J］.生命科學(xué)儀器，2005，3（2）：51-52.

［6］魯衛(wèi)平，顧大勇，王華，等.基于納米金的顯色基因芯片快速檢測病原微生物［J］.生物技術(shù)通報，2008（3）：95-98.

［7］陳福生，羅信昌，周啟，等.酶聯(lián)免疫吸附法快速檢測儲存糧食中的污染曲霉［J］.中國糧油學(xué)報，1999（1）：51-54.

［8］劉琳琳.免疫微球檢測金黃色葡萄球菌與鏈球菌研究［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（2）：193-195.

［9］張菊梅，吳清平，李程思，等.生物發(fā)光法微生物快速檢測試劑的性質(zhì)及其影響因素研究［J］.微生物學(xué)通報，2006，33（3）：36-41.

［10］王不強(qiáng)，陳祥貴.食品有害微生物快速檢測［J］.生命科學(xué)儀器，2008，6（4）：17-20.

［11］李艷霞，吳松浩.食品微生物檢測技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2008（7）：270-272.

［12］張勇兵.氣相色譜法在微生物檢測中的應(yīng)用［J］.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，15（1）：291-293.

［13］SCHMIDTH，TADJIMUKHAMEDOVKF，DOUGLASMK，et a1.Quantitative assessment and optimization of parameters for pyrolysis ofbacteria with gas chromatographic analysis［J］.Journal of Analytical and Applied Pyrolysis，2006，76：161-168.

［14］MADDULA S，BLANK ML，SCHMID A，et a1.Detection of volatile metabolites of Escherichia coli by multi capillary column coupled ion mobility spectrometry［J］.Anal Bioanal Chem，2009，394（3）：791-800.

［15］葉瑞洪.分析科學(xué)的寵兒-毛細(xì)管電泳［J］.福建師范大學(xué)福清分校學(xué)報，2001（2）：53-58.

Detection technologies and prevention methods offood and grain microorganism

TIANYang-yuan**LI Rui-fang
（College ofbioengineering，Henan universityoftechnology，Zhengzhou 450001，China）

In order to provide valuable advising for food and grain storege，an overview of technologies and their principles of food and grain microorganism detection and identification was given and the prevetion methods were summarized.

food and grain microorganism；microbiological detection technolgy；prevention method

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計劃（2008051）**田泱源，男，1987年出生，在讀碩士研究生，研究方向為微生物學(xué)。

2010-09-02