戴汝琳,王瑞雪,張志紅,董 媛,劉睿智,李付彪

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心,吉林 長(zhǎng) 春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 男科,吉林 長(zhǎng) 春 130021)

兩例Y染色體嵌合體核型合并Y染色體微缺失病例分析

戴汝琳1,王瑞雪1,張志紅1,董 媛1,劉睿智1,李付彪2*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心,吉林 長(zhǎng) 春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 男科,吉林 長(zhǎng) 春 130021)

目的報(bào)道兩例染色體嵌合體合并Y染色體微缺失的男性無(wú)精子癥患者。方法利用細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析染色體核型;PCR技術(shù)檢測(cè)外周血AZF、SRY基因及血清生殖激素檢查為輔助檢查。結(jié)果核型分析確定兩例患者均為嵌合體,一例為46,XX/47,XXdel(Y)(q11),比例是19∶41。SRY基因存在,但 Y染色體 AZFc、d區(qū) sY152,sY157,sY254,sY255位點(diǎn)缺失。激素水平:高促卵泡激素,高黃體生成素,睪酮水平下降;一例為46,XY/45,X(Y＜G),比例是51∶9。SRY基因存在,AZFb、c、d區(qū)sY127,sY152,sY157,sY254,sY255位點(diǎn)缺失。激素水平:高黃體生成素,睪酮水平下降。結(jié)論Y染色體上AZFc和AZFd區(qū)上的基因可能與Y染色體穩(wěn)定性相關(guān),染色體嵌合體患者有必要進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)。

無(wú)精子癥;染色體嵌合體;AZF

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1393)

精子發(fā)生是指從生精上皮的干細(xì)胞發(fā)育到成熟精子的一系列復(fù)雜變化過(guò)程,受多個(gè)基因調(diào)控[1]。其中任何一環(huán)節(jié)異常均可導(dǎo)致男性不育。Y染色體長(zhǎng)臂上存在與精子發(fā)生相關(guān)的基因,即無(wú)精子因子(azoospermia factor,AZF),AZF可劃分為AZFa、AZFb、AZFc、AZFd四個(gè)區(qū)域,對(duì)精子生成起十分重要的作用。

近年來(lái)有證據(jù)表明,男性不育尤其是無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精子癥的發(fā)生與遺傳因素有關(guān),主要與Y染色體微缺失和染色體異常有關(guān)。在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中,Y染色體微缺失的頻率為0.4%-55%,大約10%-15%無(wú)精子癥患者和5%-10%嚴(yán)重少精子癥患者存在Y染色體微缺失[2]。在男性不育患者中染色體異常發(fā)生率為2%-5%,在無(wú)精子癥中更高達(dá)15%[3]。本文報(bào)道2例染色體嵌合體合并Y染色體微缺失的患者,對(duì)其進(jìn)行整理分析如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

患者1:男,29歲,因婚后不育而就診?；颊唧w征正常,自述結(jié)婚七年,夫妻生活正常而妻未曾受孕,其父母非近親婚配,有十年吸煙史,工作環(huán)境接觸噪聲和振動(dòng)。睪丸左右側(cè)均2 ml,質(zhì)地軟。超聲提示:前列腺實(shí)質(zhì)回聲,不均勻。CASA精液分析顯示:未見(jiàn)精子,白細(xì)胞4-5/HP。

患者2:男,33歲,因婚后不育而就診?；颊唧w征正常,自述結(jié)婚三年,妻未曾受孕,夫妻性生活時(shí)間短,其父母非近親婚配,左側(cè)精索靜脈曲張術(shù)后。睪丸左右側(cè)均12 ml,質(zhì)地軟。有雙側(cè)乳腺發(fā)育。CASA精液分析顯示:未見(jiàn)精子。

1.2 方法

1.2.1 血清生殖激素檢查 放射免疫分析法測(cè)定血清卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、泌乳素(PRL)、雌二醇(E2)、睪酮(T)水平。試劑盒購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司,操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。正常參考值如下:FSH:0.8-15 mIU/ml;LH:0.4-6.8 mlU/m1;PRL:70-480 μ IU/ml;E2:10-100 pg/ml;T:3.2-15.6 ng/ml。

1.2.2 染色體核型檢查 取外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后,常規(guī)制備染色體標(biāo)本,G顯帶分析計(jì)數(shù)30個(gè)中期分裂相,分析3-5個(gè)核型,異常者加倍計(jì)數(shù)、分析,結(jié)果按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN,1985)進(jìn)行表達(dá)。

1.2.3 Y染色體微缺失檢測(cè) 引物設(shè)計(jì):10對(duì)檢測(cè)位點(diǎn)為:sY84、sY86、sY127、sY134、sY143、sY157、sY254、sY255、sY152和SRY。ZFX/ZFY為內(nèi)控引物。9對(duì)引物和內(nèi)控引物設(shè)計(jì)同文獻(xiàn)[4]。SRY引物序列 PrimerF:5′-GAATATTCCCGCTCTCCGGAG-3′,Primer R:5′-ACCTGTTGTCCAGTTGCACT-3′,SRY 基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為419 bp。(引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。

提取外周血DNA:抽取患者外周血2ml,EDTA抗凝,用酚-氯仿抽提法常規(guī)提取全血基因組DNA。PCR擴(kuò)增及電泳分析:設(shè)置正常男性陽(yáng)性對(duì)照、女性陰性對(duì)照、水為空白對(duì)照。PCR總反應(yīng)體系10 μ l,在AmplitronⅡPCR儀上完成PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件是:預(yù)變性94℃6 min,變性 94℃40 s,55℃45 s,72℃60 s,35個(gè)循環(huán);72℃最后延伸6 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后,取出PCR產(chǎn)物,加6×上樣緩沖液1-2 μ l?；靹蚝簏c(diǎn)樣于 1.5%瓊脂糖凝膠(0.5 μ g/ml EB),80v電泳35 min。紫外透射儀觀察結(jié)果,記錄電泳結(jié)果并拍照。

結(jié)果判斷:當(dāng)PCR反應(yīng)后的電泳結(jié)果在目的基因片段長(zhǎng)度上有擴(kuò)增顯帶出現(xiàn),陽(yáng)性對(duì)照正常顯帶,陰性對(duì)照未見(jiàn)顯帶,確認(rèn)該基因位點(diǎn)存在;電泳結(jié)果未見(jiàn)擴(kuò)增基因顯帶,且重復(fù)3次(及以上)PCR擴(kuò)增后仍無(wú)目的顯帶出現(xiàn),而對(duì)照基因能正常顯帶,此時(shí)判定該基因位點(diǎn)缺失。

2 結(jié)果

2.1 血清生殖激素檢查

患者1:睪酮(T):1.70 ng/ml↓;促卵泡激素(FSH):17.00 mIU/ml↑;黃體生成素(LH):12.50 mIU/ml↑;催乳素(PRL):370.00 μ IU/ml;雌二醇(E2):31.50 pg/ml。

患者2:睪酮(T):2.50 ng/ml↓;促卵泡激素(FSH):12.00 mIU/ml;黃體生成素(LH):7.20 mIU/ml↑;催乳素(PRL):210.00 μ IU/ml;雌二醇(E2):66.00 pg/ml。

2.2 染色體核型分析

患者1:兩次染色體核型分析均顯示46,XX/47,XXdel(Y)(q11),比例是19∶41。圖 1顯示G 顯帶原圖結(jié)果,圖A',B'分別顯示對(duì)A,B分析后的圖示。

圖1 患者1的染色體核型分析結(jié)果(A與A':47,XXdel(Y)(q11)核型;圖 B與 B':46,XX核型)

患者2:兩次染色體核型分析均顯示46,XY/45,X(Y＜G),比例是51∶9。圖2顯示G顯帶原圖結(jié)果,圖C',D'分別顯示對(duì)C,D分析后的圖示。

圖2 患者2的染色體核型分析結(jié)果(C與C':46,XY核型;圖D與 D':45,X核型)

2.3 Y染色體微缺失檢測(cè)

患者1:sY152、sY157、sY254、sY255 位點(diǎn)缺失,SRY基因存在。本患者進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增,結(jié)果均相同,陽(yáng)性對(duì)照有顯帶,陰性對(duì)照和空白對(duì)照都沒(méi)有顯帶,證明這 3次實(shí)驗(yàn)的可靠性。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3A。

患者 2:sY127、sY152、sY157、sY254、sY255 位點(diǎn)缺失,SRY基因存在。同上,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3B。

圖3 患者1 PCR電泳結(jié)果(A),患者2 PCR電泳結(jié)果(B)

3 討論

染色體核型異?？捎捎H代遺傳或子代新生突變而發(fā)生。具有兩種或兩種以上細(xì)胞系的個(gè)體稱為嵌合體。嵌合體發(fā)生原因是正常精子和卵子受孕形成合子。合子細(xì)胞最初是正常的,但在以后的某次有絲分裂時(shí)發(fā)生了細(xì)胞分裂而染色體不分離,導(dǎo)致染色體數(shù)目異常而在體內(nèi)形成三種細(xì)胞核型,一種細(xì)胞中含有正常數(shù)目的染色體,一種細(xì)胞中含有47條染色體(稱為三體細(xì)胞),而另外的一種細(xì)胞種含有45條染色體(稱為單體細(xì)胞)。因?yàn)閱误w型個(gè)體細(xì)胞中缺少一條染色體將造成基因組嚴(yán)重失衡,所以在常染色體單體型中,即使是最小的2l、22號(hào)染色體單體型病例也難以存活。本文患者均為嵌合體個(gè)體,一例患者核型為克氏征嵌合型,一例核型為單體細(xì)胞和正常細(xì)胞嵌和。一般認(rèn)為嵌合體患者的臨床癥狀在很大程度上取決于異常細(xì)胞與正常細(xì)胞比例。異常核型細(xì)胞數(shù)目越多,對(duì)表型和功能的影響越嚴(yán)重。

克氏綜合征亦稱為先天性曲細(xì)精管發(fā)育不全,是一種性染色體異常所致的疾病,是臨床最常見(jiàn)的男性性腺功能低下疾病,系高促性腺激素性腺功能低下。其典型染色體核型為47,XXY;非典型染色體核型為 48,XXXY、49,XXXXY;嵌合型如 46,XY/47,XXY、46,XX/47,XXY等。本文患者嵌合克氏征核型是46,XX/47,XXdel(Y)(q11),比例是19:41。此類核型患者在臨床上多表現(xiàn)為性別分化異常,本例查體未見(jiàn)兩性畸形,僅為小睪丸,SRY基因存在,但患者有Y 染色體 AZFc、d 區(qū) sY152、sY157、sY254、sY255 位點(diǎn)缺失。有文獻(xiàn)顯示非嵌合克氏征患者精液中有精子檢出[5][6],多表現(xiàn)為高FSH、高LH,而T下降。本文嵌合克氏征患者精液離心未見(jiàn)精子,也表現(xiàn)為高FSH,高 LH,而 T 下降。

另一例嵌合體患者核型是46,XY/45,X(Y＜G),比例是51∶9。本例患者還有Y 染色體AZFb、c、d區(qū)sY127,sY152,sY157,sY254,sY255位點(diǎn)缺失。該患者sY127丟失,代表在AZFb區(qū)RBMY1基因有丟失,sY254和sY255丟失,代表在AZFc區(qū)的DAZ基因丟失,這些基因缺失,是導(dǎo)致患者不育和精子發(fā)生障礙的主要原因[7]。本患者激素水平表現(xiàn)為高LH,而T下降。

總之,本文兩例患者均是嵌合體,且合并Y染色體AZF c、d區(qū)位點(diǎn)缺失,推測(cè)位于AZFc和AZFd區(qū)上基因不僅與精子發(fā)生有關(guān),可能還與Y染色體穩(wěn)定性相關(guān)。Y染色體AZF缺失和本身嵌合體核型可能會(huì)進(jìn)一步加劇精子發(fā)生衰竭。兩例患者均表現(xiàn)為無(wú)精子,建議患者配偶接受供精人工受精。

因此,對(duì)于男性不育診斷,除進(jìn)行常規(guī)臨床、實(shí)驗(yàn)室檢查及細(xì)胞遺傳學(xué)檢查外,還需行Y染色體微缺失檢測(cè),以進(jìn)一步明確診斷。

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[7]高小燕,楊國(guó)鋒,孫 燕,等.AZF微缺失與男性不育[J].生殖與避孕,2006,26(5):302.

Analyses for two patients of chromosomal chimaera and Y chromosomal microdeletions

DAI Ru-lin,WANGRui-xue,ZHANG Zhi-hong,et al.(Center of reproductivemedicine,The First Hospital,JilinUniversity,Norman Bathune Medicine College,JilinUniversity,Changchun130021,China)

ObjectiveTo report two male azoospermic cases of chromosomal chimaera and Y chromosomal microdeletions.MethodsUsing the karyotype analysistechnique to analyze karyotype,PCR assay for Y chromosome microdeletions,serum endocrine hormone to assist.ResultsTwo cases all have chromosomal chimaera.One case karyotype is 46,XX/47,XXdel(Y)(q11),ratio is 19:41.SRY gene exist,but have sY152,sY157,sY254,sY255 microdeletions in the AZFc+d region.The levels of hormone are high follicle-stimulating hormone,high luteinizing hormone,low testosterone.One case karyotype is 46,XY/45,X(Y＜G),ratio is 51:9.SRY gene exist,but have sY127,sY152,sY157,sY254,sY255microdeletions in the AZFb+c+d region.The levels of hormone are high luteinizing hormone,low testosterone.ConclusionThe genes of AZFc and AZFd regions in Y chromosome could have relationships with the stability of Y chromosome.The patients of chromosomal chimaera should detect Y chromosome microdeletions.

azoospermia;chromosomal chimaera;AZF

R698+.2

A

1007-4287(2010)09-1393-04

吉林省科技發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(20080444-3)

*通訊作者

戴汝琳(1983-),女,在讀博士研究生,主要從事生殖醫(yī)學(xué)研究。

2010-01-08)