朱載華，孫莉，陳丹，張乾坤，嘉婷，鄒正平，朱小春

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，浙江 溫州 325000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是常見的自身免疫性疾病，目前尚無根治方法，其發(fā)病機制尚未完全清楚，目前認為表觀遺傳學(xué)機制，特別是DNA甲基化在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機制中起了非常重要的作用。三氧化二砷（ATO）作為我國中藥砒霜的主要成分，在臨床上用于治療急性早幼粒細胞白血病取得一定療效[1]，且已有研究證實，ATO能下調(diào)MRL/lpr狼瘡小鼠FasL、IFN-γ、自身抗體、RF等水平，抑制淋巴組織增生、皮膚損害、肺和腎臟的炎性浸潤、腎臟的免疫復(fù)合物沉積并延長MRL/lpr狼瘡小鼠生存時間[2]。本課題組亦有研究證實ATO能降低BXSB小鼠血清中抗dsDNA水平，抑制腎小球中IgG的沉著，延長狼瘡鼠的生存時間[3]。鑒于DNA甲基化在SLE的發(fā)病機制中的重要作用及ATO對MRL/lpr狼瘡小鼠的治療作用，本研究將討論ATO對MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子甲基化水平的影響，從遺傳學(xué)的發(fā)病機制方面為ATO治療SLE提供重要的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑 ATO、5-氮雜胞苷（5-AzaC）和植物血凝素P（PHA-P）均為Sigma公司產(chǎn)品；白介素-2（IL-2）為上海華新生物高技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RPMI 1640和胎牛血清（FCS）為Gibco公司產(chǎn)品；淋巴細胞分離液為天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；Dynal Mouse CD4 Nega-tive Isolation Kit為挪威Dynal公司產(chǎn)品；流式相關(guān)的大鼠抗小鼠TH細胞IgG-FITC為eBioscience公司產(chǎn)品；基因組DNA小量抽提試劑盒和質(zhì)粒小量抽提試劑盒均為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA 甲基化試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒為ZYMO公司產(chǎn)品；PCR試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖（X-Gal）均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；PCR引物序列由上海基康生物有限公司合成；E.coli DH5α為本實驗室保存。

1.2 實驗動物 16～18周雌性MRL/lpr狼瘡小鼠，體重33～36 g；16～18周雌性C57BL/6J小鼠，體重25～30 g購自上海斯萊克實驗動物有限公司，SPF級實驗動物房飼養(yǎng)。

1.3 細胞培養(yǎng)與處理 取雌性MRL/lpr狼瘡小鼠6只，雌性C57BL/6J小鼠8只，頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離脾臟，并采用密度梯度離心法自脾臟中分離小鼠單個核細胞，免疫磁珠法分選脾臟CD4+T細胞，流式細胞術(shù)（FACS）檢測細胞純度。用10%FCS1640將MRL/lpr小鼠淋巴脾臟CD4+T細胞濃度調(diào)整為1×106/mL，重懸于24孔板（1 mL/孔）。于37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)。各組細胞培養(yǎng)后均采用臺盼藍染色法測定細胞存活率。細胞存活率＝（染色陰性細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。各組均大于95%。體外經(jīng)PHA-P（終濃度20μg/mL）和IL-2（終濃度1000 IU/mL）刺激48 h后隨機進行如下分組：①PBS組（n=9）：空白對照；②ATO組（n=9）：1μmol/L ATO作用24 h；③ATO+5-AzaC組（n=9）：1μmol/L 5-AzaC作用72 h后1μmol/L ATO作用24 h。

1.4 基因組DNA抽提及亞硫酸氫鹽修飾 收集各分組細胞懸液于Eppendorf管，離心后采用碧云天基因組DNA小量抽提試劑盒抽提DNA，用貝克曼分光光度儀DU800檢測DNA純度，各組DNA OD260/OD280的范圍均在1.8至2.0之間。抽提得到的基因組DNA，采用ZYMO公司DNA甲基化試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾。DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后，CpG島中的非甲基化胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）；而CpG島中的甲基化胞嘧啶（mC）仍保留為胞嘧啶（C）。CpG島以外序列中的胞嘧啶（C）均轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），經(jīng)PCR擴增后均為胸腺嘧啶（T）。

1.5 PCR擴增IFN-γ基因啟動子、DNA凝膠回收、克隆、轉(zhuǎn)化及測序 以亞硫酸氫鹽修飾的基因組DNA為模板，采用巢式PCR進行擴增，PCR引物序列參照文獻[4]，即外部引物：5’-GGTGTGAAGTAAAAGT GTTTTTAGAGAATTTTAT，3’-CAATAACAACCAAAAACAA CCATAAAAAAAAACT；內(nèi)部引物：5’-TAGAGAATTTTATAA GAATGGTATAGGTGGGTAT，3’-CCATAAAAAAAAAC TACAAAACCAAAATACAATA?？偡磻?yīng)體系50μL：10×PCR Buffer 5μL、dNTP Mixture 4μL、上下游引物（20 pmol/mL）各0.5μL、Takara Taq 0.25μL、樣本DNA 1μL、去離子水38.75μL，采用降落PCR擴增，退火溫度先從59 ℃到52 ℃，每2個循環(huán)下降1 ℃，再50 ℃擴增30個循環(huán)。擴增后的DNA用2%瓊脂糖膠進行分離，采用ZYMO公司DNA凝膠回收試劑盒回收目的DNA?；厥盏腄NA和pMD-19T載體16 ℃連接30 min，按文獻[5]制備感受態(tài)細胞E.coli DH5α，連接物轉(zhuǎn)染細胞，均勻涂布于含有X-Gal、IPTG和氨芐西林（Amp）的LB-瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜。從LB平板上挑取單個白色菌落，接種入LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜。取菌液，采用碧云天質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。質(zhì)粒抽提初步電泳鑒定后送上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.6 測序結(jié)果分析 采用基于網(wǎng)絡(luò)的在線生物信息學(xué)工具QUMA[6]分析測序結(jié)果。IFN-γ基因啟動子平均甲基化率=（啟動子區(qū)甲基化的CpG個數(shù)/啟動子區(qū)總CpG個數(shù)）×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理方法 兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，方差不齊時采用校正t檢驗，多組間比較采用方差分析，方差不齊時采用Dunnett’s t3檢驗。

2 結(jié)果

采用CpG對平均甲基化程度來評估啟動子甲基化水平。IFN-γ啟動子區(qū)包含6個CpG位點，MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ啟動子CpG位點分布及各不同藥物處理組甲基化狀態(tài)見圖1，圖2為測序圖，截取圖1中各組中第一個克隆為代表。PBS組MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ啟動子平均甲基化水平低于C57BL/6J小鼠，差異有顯著性（平均甲基化率0.074±0.121 vs 0.639±0.245，P=0.001）。MRL/lpr小鼠CD4+T細胞ATO處理組平均甲基化水平上升，與PBS空白對照組差異有顯著性（平均甲基化率0.407±0.324 vs 0.074±0.121，P=0.044）；ATO+5-AzaC組的甲基化水平上升，與PBS空白對照組差異有顯著性（平均甲基化率0.482±0.386 vs 0.074±0.324，P=0.038）；ATO組與ATO+5-AzaC組的甲基化水平差異無顯著性（平均甲基化率0.407±0.324 vs 0.482±0.386，P=0.959）（見圖3）。

圖1 亞硫酸氫鹽修飾的MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子甲基化分析，圓圈代表CpG位點，●表示甲基化狀態(tài)，○表示非甲基化狀態(tài)

圖2 MRL/lpr小鼠CD4+T細胞各不同藥物處理組的測序圖，取各組中第一個克隆為代表，**為CpG位點標志

圖3 MRL/lpr小鼠CD4+T細胞不同藥物處理組的IFN-γ基因啟動子甲基化水平（n=9，F(xiàn)=4.736，*P<0.05）

3 討論

SLE患者T細胞DNA呈低甲基化水平，其基因組DNA甲基化程度為1%，低于正常人的2.5%～4.5%，且SLE患者T細胞DNA甲基化酶（DNMT）的活性僅為正常人的1/3～1/2[7]。甲基化抑制劑如5-AzaC處理鼠或人克隆CD4+T細胞后，能改變基因的表達，誘發(fā)狼瘡樣綜合征[8]，提示T細胞DNA低甲基化可能在SLE發(fā)病中起重要的作用。Bird等[9-11]報道，導(dǎo)致IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄表達量增加的主要機制是IFN-γ基因啟動子低甲基化。用亞硫酸氫鹽測序法顯示人和小鼠T細胞中IFN-γ基因啟動子區(qū)域均有5～7個CpG對，這些位點的甲基化狀態(tài)與IFN-γ轉(zhuǎn)錄翻譯水平呈負相關(guān)。

Fas基因隱性突變的MRL/lpr小鼠作為常用的SLE動物模型之一，其出現(xiàn)與人類SLE類似的自身免疫綜合征，發(fā)病期DNA甲基化水平明顯下降，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（Dnmt1）表達明顯下降[12-14]。本實驗中PBS組MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子平均甲基化率為0.074±0.121，相對于正常對照C57BL/6J小鼠PBS組的0.639±0.245，顯示明顯去甲基化，與Mizugaki等[13]的研究相一致，進一步驗證了DNA低甲基化和狼瘡的發(fā)病具有一定的相關(guān)性。

本課題組體外實驗[15]已證實1μmol/L濃度ATO作用24 h，能夠逆轉(zhuǎn)MRL/lpr狼瘡小鼠CD4+T細胞活化狀態(tài)下IFN-γ分泌和轉(zhuǎn)錄水平的異常高表達，但其機制尚不清楚。研究表明砷劑能通過改變DNA甲基化水平來影響、調(diào)控著某些基因的轉(zhuǎn)錄，Chanda等發(fā)現(xiàn)砷劑能引起p53和p16基因啟動子的高甲基化，其甲基化程度與砷的劑量呈正相關(guān)。故本實驗假設(shè)ATO通過促進CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子的甲基化，從而抑制其基因的表達。已有實驗證實ATO能提高MRL/lpr小鼠的脾臟與淋巴結(jié)DNA整體甲基化水平[16]，但只是間接說明ATO抑制T細胞IFN-γ的轉(zhuǎn)錄可能是通過DNA甲基化途經(jīng)來調(diào)控，本實驗則直接測定MRL/lpr狼瘡小鼠CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子甲基化率來證實上述的假設(shè)。本實驗結(jié)果顯示ATO處理的MRL/lpr小鼠CD4+T細胞平均甲基化水平與空白對照組相比有明顯的上升（平均甲基化率0.407±0.324 vs 0.074±0.121，P=0.044），加入甲基化特異性抑制劑5-AzaC，ATO仍然能促進MRL/lpr小鼠CD4+T細胞IFN-γ啟動子的甲基化（平均甲基化率0.482±0.386 vs 0.074±0.324，P=0.038），進一步肯定了ATO促進CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子的甲基化的作用。

綜上所述，MRL/lpr小鼠脾臟CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子呈低甲基化水平，1μmol/L ATO作用24 h能提高活化狀態(tài)下以及5-AzaC預(yù)處理后的MRL/lpr小鼠脾臟CD4+T細胞IFN-γ基因啟動子甲基化水平。但是ATO是否通過DNMT與DNA去甲基化酶（dMTase）相互作用，從而影響甲基化水平，尚未清楚，這是我們下一步研究的重點。

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