陳天祥, 陳寒青, 陳曉明, 于陽(yáng), 徐學(xué)明, 金征宇＊

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

無(wú)花果曲霉固態(tài)發(fā)酵中菊粉酶的提取工藝

陳天祥1,2, 陳寒青1,2, 陳曉明1,2, 于陽(yáng)1,2, 徐學(xué)明1,2, 金征宇＊1,2

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

對(duì)無(wú)花果曲霉固態(tài)發(fā)酵中菊粉酶的提取工藝進(jìn)行了研究。主要研究了溶劑種類、提取時(shí)間、固液質(zhì)量體積比、振蕩頻率和提取溫度等因素對(duì)酶活的影響,確定了最佳提取工藝:以p H為4.5的0.1 mol/L醋酸緩沖液為提取溶劑,提取時(shí)間40 min,固液質(zhì)量體積比1∶20.5,振蕩頻率為207 r/min,提取溫度39.6℃,菊粉酶的提取得率相對(duì)于初始提取條件可以提高50%以上。

無(wú)花果曲霉;菊粉酶;固態(tài)發(fā)酵;提取工藝

菊粉酶是一種主要來(lái)源于微生物的多糖水解酶,可催化水解菊粉中的β-2,1糖苷鍵,生產(chǎn)高果糖漿和低聚果糖[1-3]。低聚果糖是一種水溶性膳食纖維,具有低熱能值、抗齲齒、增殖腸道內(nèi)雙歧桿菌等優(yōu)點(diǎn),是常用的功能性食品添加劑。利用菊粉酶水解菊粉生產(chǎn)果糖,相對(duì)于傳統(tǒng)的淀粉轉(zhuǎn)化法,果糖得率可由45%提高到90%以上。菊粉酶的生產(chǎn),傳統(tǒng)方法一般采用液態(tài)發(fā)酵。近年來(lái),也有學(xué)者報(bào)道使用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)菊粉酶[4-7]。

固態(tài)發(fā)酵相對(duì)于液態(tài)發(fā)酵具有成本低、工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)酶活力高等眾多優(yōu)點(diǎn),在酶制劑生產(chǎn)上具有巨大的潛力。但在固態(tài)發(fā)酵中,各種發(fā)酵代謝產(chǎn)物在固體曲中高濃度積累,這也為下游工程的處理帶來(lái)了困難。目前對(duì)固態(tài)發(fā)酵的研究大多集中在微生物發(fā)酵方面,對(duì)如何有效地把發(fā)酵代謝產(chǎn)物從固體曲中提取出來(lái)研究較少,而在整個(gè)生物工藝過(guò)程中,產(chǎn)物的回收成本占整個(gè)生產(chǎn)成本的80%以上,因而研究固體曲中發(fā)酵產(chǎn)物的提取具有重要意義[8]。Ramadas[9]等利用雙水相法從固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中提取淀粉葡糖苷酶;Ikasari[10]等研究了不同條件下固體曲中蛋白酶的提取效果;Castilho[11]等采用了不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯苛斯虘B(tài)發(fā)酵中果膠酶的提取;Marcio Mazutti[12]等利用酵母固態(tài)發(fā)酵甘蔗渣生產(chǎn)菊粉酶,并研究了菊粉酶的提取條件。

作者利用無(wú)花果曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶,系統(tǒng)研究了固體曲中菊粉酶的提取工藝,主要考察了溶劑種類、時(shí)間、溫度、振蕩頻率和固液質(zhì)量體積比等因素對(duì)菊粉酶提取得率的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 無(wú)花果曲霉,作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 菊粉:優(yōu)級(jí)純,Sigma公司,用于酶活測(cè)定;菊芋粉:由菊芋洗凈、去皮、切片,50℃烘干粉碎而得,用于培養(yǎng)基;SW-CJ-1F雙人單面超凈工作臺(tái):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;HYG-A型回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖瓶柜:江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品;UV-2100紫外分光光度計(jì):尤尼科上海儀器有限公司產(chǎn)品;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市儀器制造有限公司產(chǎn)品;THZ-82A水浴恒溫振蕩器:金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基

1)斜面培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯(洗滌,去皮,切碎)200,葡萄糖15,瓊脂20。

2)種子培養(yǎng)基(g/L):菊粉20,蛋白胨20,酵母膏10。

3)固體培養(yǎng)基:250 mL三角瓶中添加固體基質(zhì)麩皮10 g,菊芋粉11.47%,NH4H2PO40.76 %,NaCl 0.5%,MgSO40.05%,ZnSO40.01%, KH2PO40.1%,玉米漿5.71%,吐溫-80 0.5%(均為相對(duì)于固體基質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)),固液質(zhì)量體積比1 g∶1.3 mL,初始p H 5.5。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1)斜面培養(yǎng)方法:30℃培養(yǎng)72 h。

2)種子培養(yǎng)方法:250 mL的三角瓶裝液30 mL,121℃滅菌15 min,接種后,30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h。

3)固態(tài)培養(yǎng)方法:接種后,121℃滅菌30 min, 28℃靜止培養(yǎng)72 h,期間翻曲3～4次。

1.2.2 菊粉酶的提取 實(shí)驗(yàn)所用固體發(fā)酵曲均來(lái)自同一批發(fā)酵樣,經(jīng)混勻后在-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。每次取出一定量發(fā)酵曲,加入一定比例溶劑,振蕩提取一定時(shí)間后,紗布過(guò)濾,獲得濾液,然后在5 000 r/min離心機(jī)上離心10 min,取上清液,并記錄體積[7]。

1.2.3 菊粉酶測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[8]測(cè)定,具體測(cè)定方法如下:取0.2 mL粗酶液,加入2 mL底物(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%蔗糖溶液,用p H4.5的0.2 mol/L醋酸緩沖液配制),50℃反應(yīng)30 min后,沸水浴5 min使酶失活,然后冷卻至室溫,測(cè)定水解物中還原糖含量。在相同條件下,以直接在沸水浴中加熱5 min失活的酶液作對(duì)照。菊粉酶活力單位定義為:在上述條件下,以每分鐘轉(zhuǎn)化生成1μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 采用可旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),以液固質(zhì)量體積比、振蕩頻率、溫度3個(gè)因素作為自變量,以提取的菊粉酶酶活(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)3因素5水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果利用SAS8.1軟件分析。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Tab.1 Factors and levels of experimental design

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑種類對(duì)菊粉酶提取的影響

溶劑種類對(duì)菊粉酶提取效果的差異主要是由于溶劑離子強(qiáng)度和極性的不同。各種溶劑的提取效果如表2所示。

表2 溶劑種類對(duì)提取效果的影響Tab.2 Effect of different solvents on inulinase extraction

表2顯示,溶劑的使用能減少菊粉酶的損失,其中提取效果最好的是p H 4.5的0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液,相對(duì)于蒸餾水提取,菊粉酶酶活提高了22.9%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似,Marcio Mazutti[12]等利用p H4.8的0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液提取菊粉酶,相對(duì)于蒸餾水提取,菊粉酶酶活提高了14.1%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

可旋轉(zhuǎn)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果如表3所示。

通過(guò)SAS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,得到二次多項(xiàng)式回歸模型為:

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Experimental design and results

表4方差分析結(jié)果顯示,該模型極顯著((Pmodel>F)=0.0001),SAS軟件的分析結(jié)果顯示,該模型的決定系數(shù)為98.96%,表示僅有1.04%的變更無(wú)法用該模型解釋。因此,該模型與實(shí)際情況擬合良好,具有較好的代表性,可以對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表4方差分析顯示,X1、X2、X12、X22和X32的置信度均大于99%,對(duì)菊粉酶的提取具有極顯著影響,X3的置信度大于95%,對(duì)菊粉酶的提取具有顯著影響。X1X2、X1X3、X2X33項(xiàng)的置信度均小于90%,表明3項(xiàng)之間無(wú)明顯交互作用。

在提取過(guò)程中,酶能否充分溶散在溶劑中影響著提取效果,這不但與溶劑的加入量有關(guān),而且還與溶劑對(duì)固體基質(zhì)的溶解能力有關(guān),提取過(guò)程中,振蕩可以加快酶在溶劑中的擴(kuò)散和溶解,但是振蕩頻率過(guò)大會(huì)加大酶的機(jī)械損傷,從而使酶失活。溫度也是影響提取效果的重要因素,溫度過(guò)低可能會(huì)影響固體基質(zhì)及酶在溶劑中的溶解效果,溫度過(guò)高則酶的熱穩(wěn)定性下降,酶易失活。

經(jīng)SAS軟件分析,當(dāng)X1(固液質(zhì)量體積比)=1 g∶20.5 mL,X2(振蕩頻率)=207 r/min,X3(溫度) =39.6℃時(shí),Y值達(dá)到最大,即菊粉酶提取效果最好。

表4 方差分析表Tab.4 Analysis of variance of the regression parameters

2.3 提取時(shí)間對(duì)菊粉酶提取的影響

在確定了提取溶劑、振蕩頻率、溫度和固液質(zhì)量體積比等因素后,對(duì)菊粉酶提取所需的最佳時(shí)間進(jìn)行了考察。時(shí)間的長(zhǎng)短與酶的溶散效果、所受的機(jī)械損傷程度、熱失活程度等都有關(guān)系,由圖1可知,菊粉酶最佳提取時(shí)間為40 min。

圖1 提取時(shí)間對(duì)菊粉酶提取的影響Fig.1 Effect of time on the extraction of inulinase

根據(jù)以上所優(yōu)化的提取條件,對(duì)提取效果進(jìn)行驗(yàn)證,即在提取溶劑為p H 4.5的醋酸緩沖液,固液質(zhì)量體積比為1 g∶20.5 mL,振蕩頻率為207 r/ min,溫度39.6℃,提取時(shí)間40 min條件下對(duì)菊粉酶進(jìn)行提取,相對(duì)于最初的以水為提取溶劑,固液質(zhì)量體積比為1 g∶20 mL,振蕩頻率為150 r/min,溫度常溫,提取時(shí)間60 min條件下,菊粉酶的提取得率提高了50%以上。

3 結(jié) 語(yǔ)

對(duì)無(wú)花果曲霉固態(tài)發(fā)酵中菊粉酶的提取工藝進(jìn)行了研究,主要考察了溶劑種類、提取時(shí)間、溫度、振蕩頻率、固液質(zhì)量體積比等影響菊粉酶提取效果的因素。菊粉酶最佳的提取工藝為:以p H4.5的0.1 mol/L醋酸緩沖液為提取溶劑,提取時(shí)間40 min,固液質(zhì)量體積比1 g∶20.5 mL,振蕩頻率207 r/min,提取溫度39.6℃,菊粉酶的提取得率,相對(duì)于初始提取工藝,可提高50%以上。

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(責(zé)任編輯:朱明)

Extraction Technology of Inulinase fromAspergillus f icuum by Solid State Fermentation

CHEN Tian-xiang1,2, CHEN Han-qing1,2, CHEN Xiao-ming1,2, YU Yang1,2, XU Xue-ming1,2, J IN Zheng-yu＊1,2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The target of this study is to develop a efficient extract process of inulinase fromAspergillus f icuumby solid state fermentation.For this,the extract process parameters were carefully investigated and listed as follows:0.1 mol/L sodium acetate buffer of p H 4.5 was used for extraction solvent,the ratio of solid to liquid of 1:20.5,temperature of 39.6 C,stirring rate of 207 r/min,extraction time of 40 min.By the optimum conditions,the enzyme recovery yield was increased by more than 50%,when compared with that of the initial conditions.

Aspergillus f icuum,inulinase,solid-state fermentation,extraction technology

Q 814.1

:A

1673-1689(2010)03-0421-05

2009-06-25

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z333),中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(20070420968),江蘇省博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目(0801007B)。

＊通信作者:金征宇(1960-),男,江蘇揚(yáng)州人,工學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事碳水化合物研究。Email:jinlab2008@yahoo.com