路青, 華兆哲, 李秀芬, 葛富青, 堵國成, 陳堅

(1.江南大學環(huán)境與土木工程學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

MBR中厭氧氨氧化運行特性及微生態(tài)結(jié)構(gòu)

路青1, 華兆哲＊2, 李秀芬1, 葛富青1, 堵國成2, 陳堅2

(1.江南大學環(huán)境與土木工程學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

研究了膜生物反應器(MBR)中厭氧氨氧化(Anammox)的運行特性與微生態(tài)結(jié)構(gòu)變化。采用含氮模擬廢水進行試驗,最終獲得粒徑集中在0.2～1 mm的紅褐色厭氧氨氧化顆粒污泥。運行結(jié)果顯示,厭氧氨氧化菌能夠承受的容積負荷達0.245 kgTN/(m3·d);總氮、NH4+-N和NO-2-N去除率分別達到80%、81%、91%。水力負荷沖擊試驗表明,當HRT從14 h下降到7.9 h時,NH4+-N、NO-2-N去除率相對穩(wěn)定,分別保持在75%和85%左右,厭氧氨氧化仍然能夠穩(wěn)定進行。通過末端限制性酶切片斷長度多態(tài)性(T-RFLP)試驗發(fā)現(xiàn),反應器運行完成后微生物呈多態(tài)性分布,優(yōu)勢菌突出,其中起Anammox作用的菌屬主要為planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas,這為厭氧氨氧化運行過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化提供理論依據(jù)。

膜生物反應器;厭氧氨氧化;顆粒污泥;微生物種群分布

厭氧氨氧化(Anaerobic ammonia oxidation, Anammox)是在厭氧或缺氧條件下,厭氧氨氧化微生物以N H4+-N為電子供體,NO2--N為電子受體,生成氮氣的生物過程[1]。據(jù)報道,實驗室規(guī)模處理模擬廢水基質(zhì)氮去除速率最高達26.0 kg/(m3·d)[2],生產(chǎn)性Anammox反應器處理污泥壓濾液,基質(zhì)氮去除速率最高達9.5 kg/(m3·d)[3]。

然而Anammox在實驗室規(guī)模的反應器中啟動往往要幾個月甚至一年[4-10],在實際應用啟動階段則需要3年多[3]。主要是由于Anammox菌的生長速率低、細胞產(chǎn)率低、Anammox微生物由于大量氣泡的產(chǎn)生易被出水洗出[4]。因此,必須尋求更為有效的反應系統(tǒng)或操作方式來避免生物量的流失[5-10]。

啟動階段獲得高的生物保留量十分重要,因為即使是生物量微小的流失也會造成啟動時間的延遲[11-13]。膜生物反應器(Membrane Bioreactor, MBR)是膜組件與生物反應器的有機結(jié)合,可將幾乎全部的微生物保留在反應器中,較高的污泥濃度可使污染物去除率提高[14-15]。Wyffels[16]第一次成功把MBR運用到Canon(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite)工藝中,接著Trigo C[17]接種馴化好的Anammox顆粒污泥,研究MBR的啟動過程中發(fā)現(xiàn),在MBR中沒有出現(xiàn)NO2--N的積累、微生物以顆粒形式聚集生長。因此,MBR有利于增殖緩慢的微生物,如Anammox菌的截留生長。作者在MBR中接種普通厭氧顆粒污泥,研究反應器中Anammox的運行特性和微生物結(jié)構(gòu)變化,旨在為建立Anammox快速啟動的適宜條件提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MBR反應器及運行條件

MBR反應器見圖1。該裝置由機玻璃制成,有效容積1 L,內(nèi)徑80 mm,高220 mm。U型中空纖維膜組件由杭州浙大凱華公司生產(chǎn),孔徑為0.1～0.2μm,材質(zhì)為聚丙烯。

運行條件:p H為7.6±0.15,溫度為(32±1)℃,水力停留時間為1 d。半連續(xù)運行,具體為進水1 h,循環(huán)22.5 h,靜止0.2 h,出水0.3 h。

圖1 MBR反應器裝置圖Fig.1 Sketch of membrane reactor for anammox enrichment

1.2 接種污泥及試驗用水

反應器接種污泥來自無錫檸檬酸廠污水處理反應器的厭氧顆粒污泥,總固體質(zhì)量濃度(TS)14.8 g/L,揮發(fā)性固體質(zhì)量濃度(VS)9.6 g/L,VS/TS為0.65。試驗用水為人工模擬廢水,具體成分見表1。

表1 模擬廢水組成[17]Tab.1 Composition of the synthetic media

1.3 分析測試方法

1.3.1 物理性質(zhì)測定

1)污泥粒徑:從反應器內(nèi)取一定量污泥,用水沖洗后使之依次通過1.5、1、0.8、0.5、0.2 mm的分樣,然后將各個分樣篩截留的污泥收集,在105℃下烘干、稱重,計算不同粒徑范圍的污泥所占比例(質(zhì)量比)。

2)污泥體積指數(shù)(SVI)、TS、VS:質(zhì)量法。

1.3.2 化學分析

1)Anammox污泥活性測定[18]:在250 mL搖瓶中加入一定量待測污泥樣品,NH4+-N和NO-2-N質(zhì)量濃度均為70 mg/L的模擬廢水混合,用丁基橡膠塞密封,并用氮氣置換搖瓶頂端空氣2～3 min,避光置于30℃恒溫水浴中。根據(jù)反應進行的程度,定時測定NH4+-N、NO3--N和NO-2-N的質(zhì)量濃度?？偟?TN)=N H4+-N+NO-2-N-NO3--N。

2)氨氮:水楊酸-次氯酸鹽光度法。

3)亞硝基氮:N-(1-萘基)-乙二胺光度法。

4)總氮:紫外分光光度法。

5)p H:DEL TA 320 p H計。

1.3.3 微生態(tài)結(jié)構(gòu)分析

1)DNA提取、純化:采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒法,TaKaRa純化試劑盒法對DNA純化。

2)PCR擴增和純化:采用總細菌引物27F/ 1492R擴增體系(總體積50μL):10×PCR buffer 5μL,MgCl22 mmol/L,dNTPs 120μmol/L,正反引物各20μmol/L,模板1μL,Taq酶2.5μL,加超純水至終體積為50μL。擴增條件:94℃預變性5 min,94℃變性1 min,72℃退火1 min,30個循環(huán), 72℃延伸7min,最后4℃保存。TaKaRa純化試劑盒法對擴增產(chǎn)物純化。

3)酶切:PCR純化產(chǎn)物用MspI/HhaI2種酶分別進行消化,MspI酶切體系為(總體積為20 μL):10×Taq buffer 2.0μL,50～100 ng PCR產(chǎn)物,0.1%BSA 2μL,2.5μL酶,加超純水至終體積20μL?；旌弦涸?7℃停留過夜,然后在65℃停留10 min,滅活,12℃保留,終止反應。

消化產(chǎn)物由上?；瞪锕具M行檢測,檢測數(shù)據(jù)包含末端片斷長度和峰面積,用威斯康星—麥迪遜大學建立的基于Web(http://trflp.limnology.wisc.edu/assignment.jsp)的T-RFLP數(shù)據(jù)分析方法進行分析處理[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 MBR中厭氧氨氧化過程的物理特征

2.1.1 污泥質(zhì)量濃度 圖2顯示的是MBR中污泥總固體質(zhì)量濃度(TS)、揮發(fā)性固體質(zhì)量濃度(VS)和VS/TS比值隨時間的變化。在反應器運行過程的前期,污泥質(zhì)量濃度會有所下降,后期則逐步上升;而VS/TS比值則隨時間的增加而增加,由初始的0.66提高到0.77,表明體系中的生物量經(jīng)歷了一個減少到增加的過程。

圖2 MBR中污泥質(zhì)量濃度隨時間的變化Fig.2 Time-courses of sludge concentration in the MBR

2.1.2 污泥顏色 接種的厭氧顆粒污泥為黑色,經(jīng)過長時間馴化后變成紅褐色,且隨運行時間的延長紅色逐漸加深。根據(jù)相關報道,Anammox菌含有豐富的細胞色素c[20],成熟的厭氧氨氧化污泥呈淺紅色,污泥顏色越紅,Anammox活性越高[18,21]。因此,從污泥顏色變化看,本實驗中馴化后的微生物已具備了厭氧氨氧化菌的外觀特征。

2.1.3 污泥粒徑 反應器運行前后的污泥粒徑分布分別見圖3,4?？梢园l(fā)現(xiàn),厭氧氨氧化運行完成后,MBR內(nèi)顆粒污泥粒徑主要集中在0.2～1.0 mm之間。為了確定顆粒污泥對反應器脫氮的貢獻,測定了反應器中顆粒污泥的Anammox活性。經(jīng)計算顆粒污泥的Anammox活性約為106 mg/ kgTN/(m3·d),據(jù)此推斷顆粒污泥是MBR中Anammox功能的重要承載者。

圖3 馴化前污泥粒徑分布Fig.3 Diameter distribution of the inoculated sludge

圖4 馴化后污泥粒徑分布Fig.4 Diameter Distribution of the incubated sludge

2.2 MBR中厭氧氨氧化過程的化學特征

2.2.1 氮素的變化 Anammox反應器運行是Anammox菌的活化富集過程。由圖5～7可以看出,Anammox反應器運行的0～10 d中,由于接種顆粒污泥中存在許多異養(yǎng)菌,而進水不含有機物,污泥中異養(yǎng)反硝化菌首先利用污泥中的有機物和NO-2-N進行反硝化,隨后微生物由于自身消耗釋放出NH4+-N,導致出水NH4+-N質(zhì)量濃度高于進水,NO-2-N和NO3--N質(zhì)量濃度基本為0。由于啟動初期反應器內(nèi)出現(xiàn)強烈的反硝化,出水NO2-N幾乎為0。為了給Anammox微生物提供足夠的電子受體,第12天,將進水NO-2-N質(zhì)量濃度提高至98 mg/L。

圖5 MBR中氨氮變化曲線Fig.5 Profiles of NH4+-Nremoval in the MBR

第28天,出水NO-2-N上升為21 mg/L,為了防止基質(zhì)抑制作用,降低進水NO-2-N質(zhì)量濃度。之后出水NO-2-N穩(wěn)定。NH4+-N去除率有所升高,但是提高幅度不大且不穩(wěn)定,在10%～30%間波動。隨著Anammox菌的富集,NH4+-N和NO-2-N去除率進一步升高,出水NO3--N濃度逐步升高。Anammox菌從NO-2-N轉(zhuǎn)化為NO3--N過程中獲得還原力用于同化CO2,NO3--N的增長代表了微生物的增長。一般以N H4+-N和NO-2-N按一定比值(NH4+/NO-2-N:0.25～2)去除,標志Anammox反應的達成[22]。86 d時,去除的NH4+-N、NO-2-N和生成的NO3--N的比值為1∶1.14∶0.13,表明Anammox反應已經(jīng)成為主導反應。

圖6 MBR中亞硝基氮變化曲線Fig.6 Profiles of NO-2-Nremoval in the MBR

圖7 MBR中總氮變化曲線Fig.7 Profiles of nitrogen removal in the MBR

第87天,逐步縮短HRT至14 h,經(jīng)過23 d的運行,最終Anammox反應器的容積總氮負荷達0.245 kg/(m3·d),去除率為80%,出水NH4+-N和NO-2-N去除率分別為81%、91%。2.2.2 抗負荷沖擊能力 保持進水N H4+-N、NO-2-N質(zhì)量濃度分別為70 mg/L,以每兩天增加10%進水量的方式,研究反應器的抗水力負荷能力,以進水量提升前后的基質(zhì)去除速率的變化情況作為效能指標評價反應器運行的穩(wěn)定性。由圖8可知,當水力停留時間(HRT)由14 h縮短至7.9 h時,反應器表現(xiàn)出較好的抗沖擊能力,MBR中NH4+-N、NO-2-N去除率分別是75%、85%,而繼續(xù)縮短至5.4 h時,NH4+-N、NO-2-N去除率分別是50%、61%。說明當HRT縮短到一定程度時,進水中的N H4+-N、NO-2-N與Anammox菌接觸時間過短,反應不能達到充分。試驗期間NO-2-N和NH4+-N的去除量比值在1.1～1.3之間,表明在Anammox反應依然是主導反應,當HRT在7.9 h以上時,MBR具有良好的耐沖擊能力。

2.2.3 p H值的變化 反應器運行過程中的p H值變化見圖9。在運行初期,出水p H值遠高于進水,最高達到了8.81,這是由于啟動初期,微生物反硝化產(chǎn)堿所致。隨著NO-2-N去除率的下降,反應器內(nèi)微生物產(chǎn)堿作用減弱,p H值開始逐漸下降。由于Anammox過程是一個耗酸的過程[1],隨著Anammox菌的富集,55 d后出水p H值開始升高,最終穩(wěn)定在8.4左右。

圖8 HRT對MBR中NH4+-N和NO-2-N去除率的影響Fig.8 Effects of HRT on ammonium and nitrite removals in the MBR

2.3 MBR中厭氧氨氧化過程的微生物種群特征

圖10是用遺傳分析儀AB13700掃描微生物16S rDNA PCP擴增產(chǎn)物的HhaⅠ和MspⅠ雙酶切片段的圖譜。酶切圖譜上每一個末端限制性酶切片段(TRFs)至少代表一種類型的微生物,峰的面積反映出該種類的相對數(shù)量。從圖中可以直接地反映出MBR啟動前后污泥中微生物種類和相對數(shù)量的變化

作者對MBR系統(tǒng)中微生物的研究過程共100多天。在長時間的富集培養(yǎng)過程中,微生物種群變化十分明顯。利用Sorenson′s法計算多樣性指數(shù)(H′)。計算公式:H′=-∑(n/N)ln(n/N),式中n為每個波峰的面積,N為所有波峰的面積,算出富集前后微生物多樣性指數(shù)分別2.0、2.5,說明污泥種群數(shù)量出現(xiàn)小幅度增加,污泥中細菌種群數(shù)量變化趨勢與VS/TS變化及氮素去除情況相吻合。由圖10可以看出,MBR啟動后,污泥中優(yōu)勢菌群突出。反應器中優(yōu)勢菌群的種類、數(shù)量可能直接關系到反應器功能的強弱,因為即使在水力沖擊(HRT由14 h縮短至7.9 h)的情況下,也有助于系統(tǒng)的穩(wěn)定運行。根據(jù)生態(tài)學中的“多樣性導致穩(wěn)定性原理”,物種多樣化具有穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)的功能特征[23]。因此,MBR中微生物菌群呈現(xiàn)多樣性分布有利于穩(wěn)定的厭氧氨氧化。MBR反應器運行前后微生物種群結(jié)構(gòu)對比見圖11。

圖9 MBR中pH值變化曲線Fig.9 The changes of pH in the MBR

圖10 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物兩種酶切片段圖譜Fig.10 The 16S rDNA PCRamplified production after enzyme digestion

圖11 MBR反應器運行前后微生物種群結(jié)構(gòu)對比Fig.11 Comprison of microbial communities between before and after Anammox process in the MBR

由圖11可以看出,運行前后微生物類群發(fā)生了顯著的變化。運行后系統(tǒng)中部分菌屬如Clostridia,Flavobacteria等基本消失,出現(xiàn)planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas等新的種屬。每種類群的豐富度是其相對面積與總物種群落面積的比值。啟動成功后污泥中Betaproteobacteria(從37%到44.5%)、Gammaproteobacteria(從6%到17.1%)出現(xiàn)了不同程度的增加,Chlorof lexi(10.7%到4.8%)、Actinobacteria(17.8%到4%)、Planctomycetacia(從0%到9.5%)得到富集,浮霉狀菌的低生長率使其只有少量富集。迄今為止已確認的Anammox菌屬都歸于浮霉菌門。對于啟動后出現(xiàn)的planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas等菌屬,相關文獻已證明[24-25]其Anammox活性。而對于啟動后出現(xiàn)的其他優(yōu)勢菌屬是否具有Anammox活性,還需進一步研究。

3 結(jié) 語

1)經(jīng)運行,在MBR中成功富集得到Anammox菌,容積總氮負荷達0.14 kg/(m3·d)。通過縮短HRT加快Anammox菌生長,當HRT縮短至14 h,容積總氮負荷達0.245 kg/(m3·d),總氮去除率約80%,出水NH4+-N和NO2--N去除率分別為81%、91%。水力沖擊試驗證明,MBR有良好的耐水力沖擊能力,是一種較好的富集Anammox菌的裝置。

2)在MBR中,普通厭氧顆粒污泥經(jīng)過100多天馴化,變?yōu)榱郊性?.2～1 mm的Anammox顆粒污泥。通過分批培養(yǎng)試驗證明,顆粒污泥是MBR中起Anammox功能的重要承載者。

3)T-RFLP試驗證明,微生物群落結(jié)構(gòu)運行前后發(fā)生明顯變化,運行后整個反應器中適應厭氧氨氧化運行方式的菌種增殖較多,包括planctomyce、pirellula、gemmata、pseudomonas等。

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(責任編輯:李春麗)

Operation Characterictics and Microbial Community Distribution of Anammox in a Membrane Bioreactor

LU Qing1, HUA Zhao-Zhe＊2, LI Xiu-Fen1, GE Fu-Qing1, DU Guo-Cheng1, CHEN Jian2
(1.School of Environmental&Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The operation characteristics and microbial community distribution of Anammox process in the MBR was studied in this manuscript.Seeding with synthetic media,we found that the granular sludge with 0.2～1 mm diameter was obtained successfully.The nitrogen-loading rate amounted to 0.245 kgTN/(m3·d),and the removal efficiency of total nitrogen,N H4+-N and NO2--N was 80%,81%and 91%,respectively.Experiencing the hydraulic shock text,the HRT of MBR was gradually shorted from 14 to 7.9 h,the NH4+-N and NO2--N removal efficiencies were kept at about 75%and 85%,respectively.Based on terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)analysis,Microbial community diversity was achieved, and the predominant populations ofAnammox bacteria found inMBRsystem were theplanctomyce,pirellula,gemmata,pseudomonas after enrichment.The results presented here provided a theoretical basis for the change of microbial community during Anammox process.

membrane bioreactor,anaerobic ammonia oxidation,granular sludge,microbial community distribution

X 703.1

:A

1673-1689(2010)04-0581-08

2009-04-15

國家973計劃項目(2007CB 714036);江蘇省自然科學基金項目(BK2007022);江蘇省太湖水專項項目(BS2007125)。

＊通信作者:華兆哲(1969-),男,江蘇無錫人,工學博士,教授,博士生導師,主要從事環(huán)境生物技術(shù)方面研究。Email:huazz@jiangnan.edu.cn。