莊文斌 曾晨笛 楊愛群 肖文豪 陳吉生

鹽酸吡格列酮是目前最新的噻唑烷二酮類藥物，近年來(lái)，隨著越來(lái)越多人對(duì)鹽酸吡格列酮的研究，其制劑開發(fā)、含量測(cè)定方法學(xué)也逐漸有報(bào)道，但由于中國(guó)藥典2005版和2010版，均無(wú)收錄鹽酸吡格列酮，查閱文獻(xiàn)，關(guān)于鹽酸吡格列酮片含量測(cè)定方法，采用流動(dòng)相的有機(jī)相大多數(shù)為乙腈，由于乙腈價(jià)格昂貴、對(duì)人體的毒性較大［1］。為有效控制其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文通過(guò)方法學(xué)摸索，開發(fā)出簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、低毒及靈敏度高的測(cè)定鹽酸吡格列酮片含量的方法，為進(jìn)一步開發(fā)鹽酸吡格列酮新的制劑提供質(zhì)量控制參考。

1 儀器與試劑

儀器:Waters高效液相色譜系統(tǒng)(沃特Water科技上海有限公司):1525泵，2487可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，Breeze色譜工作站。鹽酸吡格列酮對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100634－200401);鹽酸吡格列酮片(15 mg/片，日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社，分裝批號(hào):070401;081101;090101);試劑:甲醇為色譜純;乙醇、氨水均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的摸索和確定 參考文獻(xiàn)所記載的鹽酸吡格列酮的測(cè)定方法［2］，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相品種、流動(dòng)相配比、流速、最大檢測(cè)波長(zhǎng)、pH值等進(jìn)行摸索，根據(jù)峰形、峰面積等指標(biāo)確定的色譜條件為:色譜柱:Symmetry C18柱(4.6 mm×150 mm);流動(dòng)相:甲醇:水(80:20)，用新配置的氨試液將pH值調(diào)至7.0;流速:1.0 ml/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):224 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量20 l。色譜圖見圖1。

2.2 方法學(xué)的驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取相當(dāng)于10 mg的鹽酸吡格列酮對(duì)照品，置100 ml容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成濃度為0.1 mg/ml的溶液。分別精密量取該溶液10 ml、8 ml、6 ml、5 ml、3 ml、1 ml，各置 10 ml容量瓶中，用乙醇定容，搖勻。按“2.1”項(xiàng)的色譜條件，分別進(jìn)樣三次測(cè)定。測(cè)得各濃度對(duì)應(yīng)的峰面積，以鹽酸吡格列酮的峰面積(A)對(duì)濃度(c)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，鹽酸吡格列酮在10～100μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好?；貧w方程為:A=5e+7c+42096;R2=0.9995。

圖1 鹽酸吡格列酮色譜圖

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 參考中華人民共和國(guó)藥典穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)原則［3］精密稱取約相當(dāng)于5 mg的鹽酸吡格列酮對(duì)照品，置100 ml容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成濃度為0.05 mg/ml的溶液。在本實(shí)驗(yàn)條件下分別在室溫放置不同時(shí)間(0、1、2、4、6、24 h)，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件，分別進(jìn)樣三次測(cè)定，測(cè)得各時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的鹽酸吡格列酮峰面積，計(jì)算RSD=0.96%，表明鹽酸吡格列酮的乙醇溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.3 精密度的考察 精密稱取約相當(dāng)于5 mg的鹽酸吡格列酮，置100 ml容量瓶中，加乙醇溶解并定容，搖勻，配成濃度為0.05 mg/ml的溶液。在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，其峰面積的RSD=0.36%(n=6)。

2.2.4 靈敏度-最低檢測(cè)限的考察 按照“2.1”項(xiàng)的色譜條件，取溶解鹽酸吡格列酮的乙醇溶液，進(jìn)樣20 l三次，作為空白溶液色譜圖，根據(jù)樣品出峰時(shí)間，取樣品出峰附近的一段基線來(lái)計(jì)算燥聲，測(cè)得基線噪音為1957，再配制濃度約為0.01 mg/ml鹽酸吡格列酮樣品溶液。分別精密量取該溶液8 ml、6 ml、5 ml、3 ml、1 ml，各置 10 ml容量瓶中，用乙醇定容，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件，分別進(jìn)樣三次測(cè)定，記錄出峰處信號(hào)值，見圖12，在上述色譜條件下，以S/N=3計(jì)算得鹽酸吡格列酮的最低檢測(cè)限為0.08μg。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 取已知含量的鹽酸吡格列酮片20片，精密稱定，研成細(xì)粉并混勻后，分別精密稱取約相當(dāng)于鹽酸吡格列酮4、5、6 mg，各置200 ml量瓶中，精密加入鹽酸吡格列酮對(duì)照品5 mg，加溶劑溶解并定容，搖勻，作為回收率測(cè)定用溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件，分別進(jìn)樣三次測(cè)定，記錄峰面積。由公式:回收率=(測(cè)得量-樣品中含量)/標(biāo)準(zhǔn)品加入量，計(jì)算出回收率。

圖2 鹽酸吡格列酮在最低檢測(cè)限濃度下的出峰情況

表1 鹽酸吡格列酮的回收率

2.3 樣品測(cè)定 取鹽酸吡格列酮片20片，精密稱定，研成細(xì)粉取細(xì)粉適量(相當(dāng)于鹽酸吡格列酮5 mg)，精密稱定，置100 ml量瓶中，用乙醇溶解，超聲5 min使溶解，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，制成每1 ml中約含鹽酸吡格列酮0.05 mg的溶液。按“2.1”項(xiàng)的色譜條件，測(cè)定本品三批，分別進(jìn)樣三次測(cè)定，記錄峰面積，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，結(jié)果如下:

表2 3個(gè)批次的鹽酸吡格列酮片的含量

3 討論

3.1 采用HPLC法測(cè)定鹽酸吡格列酮片的含量，最首要的是選擇合適的色譜條件和測(cè)定方法，作為HPLC的流動(dòng)相，如果選擇粘度較高的溶劑，會(huì)在分析時(shí)產(chǎn)生很高的壓力，導(dǎo)致柱子的損壞加快。在有機(jī)溶劑與水混合的時(shí)候，根據(jù)混合比例的不同，所產(chǎn)生的粘度(=壓力)的比例也會(huì)不同。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇與水的比例為50:50時(shí)，會(huì)產(chǎn)生很高的柱壓，通過(guò)調(diào)節(jié)比例得出，甲醇與水的比例往兩級(jí)增大，柱壓會(huì)下降。在洗脫能力上，乙腈比甲醇的洗脫能力強(qiáng)［4］，因此使用甲醇代替乙腈時(shí)，需要增大甲醇的比例，每次將甲醇的比例增加5%，再選擇哪個(gè)比例可以到分離要求，試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇:水=80:20時(shí)，鹽酸吡格列酮片峰形及出峰時(shí)間合適，因此確定流動(dòng)相的比例為甲醇:水=80:20，驗(yàn)證結(jié)果表明，該流動(dòng)相適合用于鹽酸吡格列酮片的含量測(cè)定。

3.2 應(yīng)用HPLC法進(jìn)行分析測(cè)定時(shí)，常常采用離子抑制法即向含水流動(dòng)相中加入弱酸、弱堿或者緩沖溶液等改性劑，以使流動(dòng)相的pH值控制一定數(shù)值，抑制溶質(zhì)的離子化，減少譜帶拖尾、改善峰形，以提高分離的選擇性［5］。

3.3 通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，本文所用的鹽酸吡格列酮含量測(cè)定方法學(xué)各項(xiàng)目均達(dá)到要求，且本測(cè)定方法簡(jiǎn)便，片劑不需提取分離，直接溶解過(guò)濾即可直接進(jìn)樣，測(cè)定時(shí)間短，只需8 min即可完成測(cè)定，流動(dòng)相簡(jiǎn)單、毒性低、價(jià)格便宜，方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、精密度高，具有較好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

［1］錢伯章．全球乙腈生產(chǎn)緊缺．合成纖維，2009，06:53．

［2］朱鵬祥，錢南萍，魏潤(rùn)新，等．鹽酸吡格列酮片的HPLC含量測(cè)定方法．江蘇藥學(xué)與臨床研究，2004，12(6):15-16．

［3］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典2005年版第二部．化學(xué)工業(yè)出版社，2005，附錄:172．

［4］高效液相(HPLC)流動(dòng)相乙腈與甲醇的區(qū)別，生物信息網(wǎng)，實(shí)驗(yàn)室安全專欄，http://www．biowww．com．cn/shiyan/safe/1970．html．

［5］宋永康，郭嘉，潘葳．影響測(cè)定反相高效液相色譜流動(dòng)相pH值的因素．現(xiàn)代科學(xué)儀器，2005，1:95-97．