閔運(yùn)江

(皖西學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系,安徽六安 237012)

植物細(xì)胞DNA提取與PCR實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及其關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)選

閔運(yùn)江

(皖西學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系,安徽六安 237012)

以草本類型的蓼科5種植物為實(shí)驗(yàn)材料,研究了DNA提取方法。探討了nrDNA ITS片段的PCR擴(kuò)增方法,通過正交試驗(yàn)法,對(duì)該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟中PCR體系主要成分的最適含量進(jìn)行了優(yōu)化。為植物細(xì)胞DNA提取和PCR擴(kuò)增這一現(xiàn)代生物學(xué)必不可少的實(shí)驗(yàn)教學(xué)和相關(guān)科學(xué)研究提供方法借鑒。

DNA提取;PCR擴(kuò)增;實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì);正交試驗(yàn);草本植物

植物細(xì)胞DNA的提取與擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)等相關(guān)專業(yè)本科生必需掌握的實(shí)驗(yàn)技能之一[1](P271-284)[2](P53-55)[3-4],屬于綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。植物細(xì)胞DNA的提取與擴(kuò)增技術(shù)又是以上專業(yè)學(xué)生進(jìn)一步進(jìn)入研究生學(xué)習(xí)階段必備的而又較難掌握的實(shí)驗(yàn)技能之一。

DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)以及PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),polymerase chain reaction)技術(shù)的建立,分子生物學(xué)得到了迅猛的發(fā)展,并已滲透到生物學(xué)的各門學(xué)科領(lǐng)域,已成為生物學(xué)各學(xué)科中發(fā)展速度最快,當(dāng)今最熱門的研究領(lǐng)域之一[5-12][13]。

DNA提取和PCR擴(kuò)增操作是研究許多生物學(xué)問題必不可少的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié),而大多數(shù)學(xué)生和研究者常常在此環(huán)節(jié)傷透腦筋。隨實(shí)驗(yàn)材料的種類、材料保存、運(yùn)輸條件的差異,以及實(shí)驗(yàn)操作過程的繁雜的實(shí)驗(yàn)條件的改變,其中任何一個(gè)參數(shù)設(shè)置或控制不好,結(jié)果就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗——無擴(kuò)增產(chǎn)物或產(chǎn)物不理想,無法測(cè)序。

因此,本文以草本類型的蓼科5種植物為例,對(duì)其進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增nrDNA的 ITS片段(核糖體基因的間隔區(qū) ITS1和 ITS2,包含5.8S基因)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟的參數(shù),通過正交試驗(yàn)法進(jìn)行探索,找到最佳實(shí)驗(yàn)條件,以期對(duì)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和研究提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料(見表1)

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)步驟

參照已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)資料[14-15]以改良CTAB (Cetyltrimethyle Ammonium Bromide,十六烷基三甲基溴化銨)法,DNA提取與PCR擴(kuò)增nrDNA ITS片段步驟如下:

(1)改良CTAB法提取DNA

稱取干樣品10～20mg→放入研缽中→加1.5角匙60～80目(AR)的石英砂→加適量液氮→研磨成粉末→將材料轉(zhuǎn)入2ml離心管中→加4×CTAB液900μl→強(qiáng)烈振蕩混勻 →置 65℃水浴保溫 60～90min,每10min振蕩一次→吸取上清液及部分樣品漿液(除去石英砂)→轉(zhuǎn)入 1.5ml離心管中 →加600μl氯仿:異戊醇 =24:1的溶液 →強(qiáng)烈振蕩 →1200°r/min離心10min→取上清液→重復(fù)一次(即:再次加600μl24:1的氯仿:異戊醇→強(qiáng)烈振蕩混勻→離心)→取上清液→加異丙醇450μl(上下移動(dòng)30S輕搖)→在-20℃(或4℃)冰箱保存15～30min(材料不好可為4～6h或過夜)→1200°r/min離心5min→此時(shí),應(yīng)看到離心管底部有白色沉淀→將此沉淀用75%乙醇洗滌1～2次,傾去乙醇→在37℃恒溫金屬浴上風(fēng)干→加50μlddH2O(無菌超純水)溶解沉淀→加2μl的RNA酶(50mg/μl)→37℃水浴30min→加5～10μl的3M的NaAC和120μl無水乙醇,-20℃保存30min→1200°r/min離心10min→400μl75%乙醇洗滌1次→400μl無水乙醇洗滌1次→離心10S→37℃恒溫金屬浴上風(fēng)干→加50μl的ddH2O溶解→電泳法檢查DNA純度→-20℃保存,備用。

至此即得到材料DNA(總DNA)模板。

(2)nrDNA ITS片段的擴(kuò)增

配制好 PCR擴(kuò)增體系,于 PCR擴(kuò)增儀(Biorad DNA Engine,上海瑞億儀器有限公司)上,擴(kuò)增程序是:

擴(kuò)增結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外檢測(cè)器檢查PCR產(chǎn)物。

表1 實(shí)驗(yàn)材料采集地信息表

1.2.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)選PCR擴(kuò)增條件

在 PCR擴(kuò)增中,PCR擴(kuò)增體系是否適宜,是PCR擴(kuò)增能否成功的關(guān)鍵之關(guān)鍵,綜合已發(fā)表的相關(guān)論文中其他學(xué)者所采用的條件,用DPS v7.05軟件設(shè)計(jì)一個(gè)L16(54)正交試驗(yàn),即5因素4水平16次試驗(yàn)的正交試驗(yàn)(表2、表3),優(yōu)選出各成分的最佳條件。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3,按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表配制好各體系,10×Buffer各 5μl,并以 dd H2O補(bǔ)足至50μl,按上述nrDNA ITS片段的擴(kuò)增程序擴(kuò)增,產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外檢查電泳有無亮帶,根據(jù)亮帶的亮度(與擴(kuò)增產(chǎn)物中DNA片段含量呈正相關(guān))判斷PCR結(jié)果是否符合要求,每組試驗(yàn)結(jié)果中以每樣品有清晰明亮的電泳帶定量為1,無亮帶為0,暗帶定義為0.1～0.9,試驗(yàn)結(jié)果見表3和圖1、2。

表2 L16(54)正交試驗(yàn)因素和水平表(50μl/體系)

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果及其關(guān)鍵影響因素

按照以上DNA提取方法,只要樣品材料干燥及時(shí),低溫保存,可以提取出植物細(xì)胞總DNA。

DNA提取的關(guān)鍵控制環(huán)節(jié)是防止DNA降解,離體的新鮮材料提取過程中,DNA極易降解。因此,采集的新鮮材料應(yīng)立即用硅膠脫水干燥,并低溫保存,提取DNA時(shí)用液氮研磨等提取過程中,保持低溫等措施,均是防止DNA降解。

同時(shí),采樣和提取DNA過程中防止污染也是試驗(yàn)必須的控制因素之一。

2.2 PCR擴(kuò)增體系優(yōu)選結(jié)果及其分析

圖1 ITS片段擴(kuò)增正交試驗(yàn)t1-t8組結(jié)果

圖2 ITS片段擴(kuò)增正交試驗(yàn)t9-t16組結(jié)果

表3 L16(54)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及電泳檢查PCR結(jié)果及其方差分析結(jié)果

各PCR條件的正交試驗(yàn)結(jié)果,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,紫外檢測(cè),根據(jù)電泳帶的清晰度,可直觀判斷各組每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物量(見圖1、2),經(jīng)量化處理和方差分析結(jié)果見表3。

從圖1、2和表3可見,處理組t8的5個(gè)樣均有較清晰的電泳帶,其他各處理組或不理想或無 PCR產(chǎn)物,說明t8組條件最佳,即A2B4C3D2E1組合的條件最佳,因此,每50μl PCR體系最佳配方是:10μM引物(1、2)各2.0μl、5U/μl的 Taq酶0.75μl、10mM的dNTP 2μl、DNA模板1μl、25mM的MgCl24μl、10 ×Buffer 5μl,并以dd H2O補(bǔ)足至50μl。

由表3的方差分析結(jié)果的極差大小可見,B>C >A>E>D,說明在本試驗(yàn)采用的各濃度范圍內(nèi), PCR體系中,引物量對(duì)PCR結(jié)果影響最大,其次是Taq酶和dNTP的量。

3 討論

植物DNA提取的方法很多,如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法、十二烷基磺酸鈉(SDS)法、PVP法、高鹽法、尿素提取法和WizardTM clean-up system試劑盒等各種試劑盒法等等[16][17](P60-67),PCR擴(kuò)增條件也隨著材料和擴(kuò)增片段不同而千差萬(wàn)別[18][19]。然而,其基本原理和大致過程是相同或相似的,尤其是同一類材料如草本植物,DNA提取方法、PCR體系組成和合理搭配及PCR程序基本可以通用。本文根據(jù)現(xiàn)有本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)條件,摸索了適合于草本類型的植物細(xì)胞DNA提取方法——改良CTAB手工提取法的提取條件,并用正交試驗(yàn)找出了其PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵因素的最佳配比水平,可為相關(guān)學(xué)科的DNA提取與擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)教學(xué)和研究提供方法借鑒。

至于PCR擴(kuò)增的另一關(guān)鍵因素——退火溫度,本試驗(yàn)設(shè)計(jì)前已進(jìn)行反復(fù)摸索,采用的是其最佳退火溫度(52℃),該文中未作詳述。

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The Experiment Design and Its Key Parameters Optimization of Isolation and PCR Amplification DNA Fragment from Plant Cell

MIN Yun-jiang
(Department of Chemistry and L if e Science,West A nhui University,L u’an237012,China)

The experiments had been designed which plant cell DNA isolation and its nrDNA ITS fragment PCR amplification,with 5 species herbaceous materials of Polygonaceae.The key step of the experiment the main components of the PCR system optimum concentration had been optimized by the orthogonal test method.The results of this experiment will provide an example to our experimental teaching and related research.

DNA isolation;PCR amplification;experiment design;the orthogonal test method;herbaceous

Q94-33

A

1009-9735(2010)02-0089-04

2010-03-18

安徽省教育廳2010年度高校省級(jí)科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2010A327)。

閔運(yùn)江(1963-),男,安徽金寨人,碩士,在讀博士,副教授,研究方向:植物分子生態(tài)。