劉 詠, 嚴(yán)小三, 張 婷

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009;2.合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

近幾十年來(lái),隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展,農(nóng)村、城市的地下水都存在著不同程度的氮污染問(wèn)題,農(nóng)業(yè)化肥的過(guò)量使用,尤其是氮肥的過(guò)量使用和動(dòng)物排泄物的處置不當(dāng),使世界許多地方地表水和地下水中硝酸鹽氮的含量在不斷升高,已經(jīng)危及包氣帶土壤和地下水的質(zhì)量安全,硝酸鹽污染日趨嚴(yán)重[1]。

土壤中的硝酸鹽主要被農(nóng)作物吸收,澆水灌溉也使硝酸鹽滲入、污染地下水體。蔬菜極易吸收和富集硝酸鹽,從調(diào)查結(jié)果[2]來(lái)看,過(guò)量施用氮肥使土壤中的硝酸鹽含量明顯升高,直接導(dǎo)致蔬菜硝酸鹽過(guò)多積累,尤其是葉菜類(lèi)[3]。硝酸鹽攝入人體后可轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽、亞硝酸胺,甚至致癌[4]。因此,開(kāi)展土壤硝酸鹽控制途徑的研究,對(duì)降低農(nóng)作物及蔬菜中硝酸鹽含量,生產(chǎn)綠色食品有著極其重要的意義。

降低土壤中過(guò)量硝酸鹽是降低農(nóng)作物與蔬菜硝酸鹽含量的根本途徑。利用微生物進(jìn)行生物反硝化作用去除地下水中過(guò)量的硝酸鹽已經(jīng)被廣泛研究[5-9]。文獻(xiàn)[10]對(duì)蘆葦濕地去除硝酸鹽污染進(jìn)行研究,分析了蘆葦在生物反硝化作用中的重要作用以及與反硝化細(xì)菌之間的關(guān)系。但生物反硝化用于去除土壤中過(guò)量硝酸鹽鮮見(jiàn)報(bào)道。為了尋求廉價(jià)而有效的土壤硝酸鹽修復(fù)途徑,本文采用從巢湖濕地土壤中分離篩選出的高效兼性厭氧的異養(yǎng)反硝化細(xì)菌Klebsiella sp.DB-1,利用廢棄的農(nóng)作物秸稈作為微生物碳源,進(jìn)行土壤硝酸鹽修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株：本實(shí)驗(yàn)室從巢湖濕地分離篩選,經(jīng)過(guò)16SDNA鑒定并保存的高效反硝化菌株 Klebsiella sp.DB-1。

土樣：從合肥工業(yè)大學(xué)校園花壇處采集地表下0.5 m深的包氣帶土壤,土壤中 w硝酸鹽氮為12 mg/kg,風(fēng)干用2 mm篩過(guò)篩備用。

富集培養(yǎng)基[11]：蛋白胨 10 g/L,硝酸鉀1 g/L,1000 mL水,pH 值為7.3～7.6。

固體碳源：玉米秸稈、稻草秸稈、蘆葦秸稈、蒲葦秸稈。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株利用農(nóng)作物秸稈去除土壤硝酸鹽氮

包氣帶土壤的生物反硝化作用是在反硝化細(xì)菌的作用下,將硝酸鹽還原為N2的整個(gè)過(guò)程,是包氣帶土壤對(duì)硝酸鹽污染的自?xún)艄δ?本文采用異養(yǎng)反硝化菌株K lebsiella sp.DB-1,對(duì)促進(jìn)地下水環(huán)境保護(hù)具有一定的實(shí)際意義。

取風(fēng)干篩分過(guò)的土樣各100 g,將4種秸稈(玉米、稻草、蘆葦、蒲葦)切碎(粒度為 5～10 mm),分別與土樣混勻,秸稈用量為每100 g土壤5 g,分裝于250 mL燒杯中,然后分別添加適量的硝酸鉀溶液,使土壤中 w硝酸鹽氮達(dá)到200 mg/kg左右,并分別添加適量的蒸餾水使土壤含水達(dá)過(guò)飽和狀態(tài),用塑料膜密封燒杯口,保持厭氧環(huán)境。滅菌后,按照土壤的用量添加菌株Klebsiella sp.DB-1的種子液,接種量為每100 g土壤10 mL,種子液每次使用前以無(wú)菌水調(diào)整其OD值(660 nm)為0.5,接種后放在28℃下恒溫培養(yǎng),每隔一定的時(shí)間取樣測(cè)定土壤硝酸鹽氮含量,根據(jù)土壤硝酸鹽氮的去除率確定最佳固體碳源。

從燒杯中隨機(jī)取土樣0.2 g,加30 mL水溶解,過(guò)濾后,加入1 mL氫氧化鋁懸浮液[12],再過(guò)濾得澄清水樣,取水樣1 mL,用酚二磺酸分光光度法[11]測(cè)量硝酸鹽氮的含量。

1.2.2 秸稈用量對(duì)硝酸鹽氮去除率的影響

各稱(chēng)取100 g風(fēng)干篩分的土樣分裝于250 mL燒杯中,將優(yōu)選出的最佳秸稈切碎,每100 g土壤中添加秸稈的量分別為 3、5、7、10、12 g,與土樣混勻,以不添加秸稈的土壤作為對(duì)照。然后分別添加硝酸鉀,使土壤中w硝酸鹽氮達(dá)到200 mg/kg左右,其余步驟同1.2.1,由所測(cè)結(jié)果確定出最佳碳源用量。

1.2.3 菌株對(duì)初始硝酸鹽氮的耐受性

采用最佳碳源及其最佳用量,使土壤中w硝酸鹽氮分別約為50、100、150、200、250 mg/kg。其余操作同1.2.1,考查菌株對(duì)初始硝酸鹽氮的耐受性。

1.2.4 土壤酸堿度對(duì)菌株反硝化活性的影響

各稱(chēng)取100 g風(fēng)干篩分的土壤分裝于燒杯中,添加適量的硝酸鉀和固體碳源混勻,測(cè)定土壤初始pH值,用0.1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值,使各燒杯土樣的 pH 值分別為 5、6、7、8、9。其余步驟同1.2.1,由所測(cè)結(jié)果確定菌株對(duì)土壤最適pH值的要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同農(nóng)作物秸稈去除硝酸鹽的效果

反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1利用農(nóng)作物秸稈作為碳源,對(duì)土壤中硝酸鹽進(jìn)行原位生物修復(fù),土壤硝酸鹽氮的去除率隨時(shí)間變化,結(jié)果如圖1a所示。

由圖1a可以看出,在整個(gè)生物反硝化過(guò)程中,土壤硝酸鹽氮的去除率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而處于上升趨勢(shì),但上升幅度因農(nóng)作物秸稈碳源的種類(lèi)而異。在0～24 h內(nèi),反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1利用蒲葦秸稈去除硝酸鹽氮的速度最快,菌株利用其它幾種秸稈均存在24 h的延遲期,起始反硝化作用較弱。24～60 h,這個(gè)階段是菌株的指數(shù)生長(zhǎng)期,菌株利用這4種秸稈去除土壤硝酸鹽氮的速度都明顯加快,硝酸鹽氮的去除率迅速提高;60 h以后,硝酸鹽氮的去除緩慢,基本達(dá)到穩(wěn)定。在生物反硝化過(guò)程中土壤硝酸鹽含量都處在一個(gè)下降的趨勢(shì),不同農(nóng)作物秸稈被反硝化細(xì)菌利用的效果存在一定的差異,但總體較好,在96 h時(shí),菌株利用蒲葦秸稈作碳源使土壤硝酸鹽氮的去除率達(dá)到94.9%,蘆葦秸稈使土壤硝酸鹽氮的去除率為88.4%,玉米和稻草分別為87.5%和 85.9%。反硝化菌株 Klebsiella sp.DB-1利用蒲葦秸稈去除硝酸鹽氮的效果最好,其次為蘆葦秸稈,玉米和稻草的反硝化效果稍差。

2.2 最佳秸稈用量

將最佳碳源蒲葦秸稈按照不同的用量比例添加到土壤中,分別接種相同的反硝化菌液濃度,蒲葦秸稈用量對(duì)菌株去除土壤硝酸鹽氮的影響,如圖1b所示。從圖1b可知,土壤中蒲葦秸稈的添加量不同,反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1的反硝化活性差異較大。當(dāng)土壤中不添加蒲葦時(shí),由于土壤本身含有少量的碳源,也能夠?yàn)榫晏峁╇娮邮荏w,土壤硝酸鹽也略有下降,可以看到土壤中硝酸鹽氮的去除率有一定的上升,在108 h硝酸鹽氮的去除率達(dá)到30.9%;而添加蒲葦?shù)牧坎煌?菌株在反硝化過(guò)程中對(duì)硝酸鹽氮的去除率總體呈上升趨勢(shì),但上升幅度不同;并不是秸稈的添加量越多越好,每100 g土中添加5 g蒲葦?shù)谋壤趯?shí)驗(yàn)周期內(nèi)硝酸鹽氮去除率上升的幅度最大,在84 h基本趨于穩(wěn)定,在108 h內(nèi)土壤中w硝酸鹽氮由394 mg/kg降低到74.5 mg/kg,硝酸鹽氮的去除率達(dá)到81.1%。因此,可以確定最佳碳源用量為每100 g土壤中5 g蒲葦。

2.3 不同含量硝酸鹽污染時(shí)的去除效果

在土壤中初始硝酸鹽氮含量不同時(shí),菌株Klebsiella sp.DB-1去除土壤硝酸鹽氮的結(jié)果,如圖1c所示。

圖1 土壤中硝酸鹽氮的變化情況

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中土壤硝酸鹽氮含量都處于下降趨勢(shì),在0～24 h內(nèi)下降比較緩慢,不同初始硝酸鹽氮含量的土壤中,硝酸鹽氮含量的下降幅度略有不同,在土壤中 w初始硝酸鹽氮為100 mg/kg下,硝酸鹽氮的去除率升高較明顯;24～48 h內(nèi),在菌株的反硝化作用下土壤硝酸鹽氮含量都迅速下降,原因可能是菌株經(jīng)過(guò)24 h的停滯期之后生長(zhǎng)繁殖迅速;下降幅度較大的是200 mg/kg土壤和250 mg/kg土壤,土壤中 w硝酸鹽氮分別降到了51.8 mg/kg和55 mg/kg;60 h以后土壤硝酸鹽氮含量下降普遍緩慢,可能是由于菌株的生長(zhǎng)周期進(jìn)入衰亡期,菌株數(shù)量減少所致。從圖3可見(jiàn),土壤中初始硝酸鹽氮含量越高,相同濃度菌液去除硝酸鹽氮的效果越好,菌株能夠耐受較高含量的硝酸鹽氮,土壤中 w初始硝酸鹽氮為 200 mg/kg和250 mg/kg的實(shí)驗(yàn)組,在108 h時(shí)硝酸鹽氮的去除率分別達(dá)到91.7%和89.9%。

2.4 不同pH值對(duì)去除土壤硝酸鹽的影響

土壤pH值對(duì)菌株去除硝酸鹽氮的影響,如圖2所示。整個(gè)過(guò)程中硝酸鹽氮含量都呈下降的趨勢(shì),在12～48 h、pH 值為7～9的實(shí)驗(yàn)組土壤硝酸鹽氮含量下降幅度較快,在48 h,pH=9的硝酸鹽氮的去除率最大(63%),到108 h時(shí)達(dá)到67.7%;pH=7實(shí)驗(yàn)組中硝酸鹽氮去除率變化趨勢(shì)不穩(wěn)定,但是整個(gè)過(guò)程中都處于增長(zhǎng)的狀態(tài),到108 h時(shí),硝酸鹽氮去除率增加到67.3%。

圖2 不同pH值下硝酸鹽氮去除率變化

當(dāng)土壤pH=5時(shí),硝酸鹽氮含量下降趨緩,最終硝酸鹽氮去除率只有49.1%,這與文獻(xiàn)[13]當(dāng)pH＜6.5時(shí)反硝化速率很快下降的研究結(jié)論相同。因而,pH值在中性偏堿(7～9)時(shí),菌株的反硝化速率比較快,效果較好。

3 討 論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn),可以確定反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1利用固體秸稈修復(fù)包氣帶土壤硝酸鹽污染具有一定的實(shí)效性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明,反硝化細(xì)菌Klebsiella sp.DB-1能夠直接利用農(nóng)作物秸稈,在一定時(shí)間內(nèi)修復(fù)土壤硝酸鹽污染。圖2所示為蒲葦秸稈作為碳源的最佳用量結(jié)果,該結(jié)果體現(xiàn)了反硝化菌株對(duì)固體碳源的需求量并非越高越好。由實(shí)驗(yàn)確定的秸稈最佳用量為每100 g土壤中5 g,即使對(duì)于大面積包氣帶土壤硝酸鹽污染的生物修復(fù),也不存在過(guò)量的問(wèn)題,原因如下：①秸稈的添加可以采用土壤翻耕的方式加入土壤中,其深度不可能影響地下水質(zhì);②由于土壤微生物的協(xié)同分解作用,秸稈被微生物分解吸收,不會(huì)直接進(jìn)入地下水而造成地下水體的二次污染;③如果菌株利用固體碳源直接修復(fù)水體硝酸鹽污染,可能會(huì)產(chǎn)生色度、COD、有機(jī)碳?xì)埩舻纫幌盗袉?wèn)題。本研究目的是降低土壤中積累的硝酸鹽,包氣帶土壤中所含的水分較少,農(nóng)作物生長(zhǎng)需要吸收水分,土壤本身具有過(guò)濾作用,因此,能夠阻控地下水體的污染。

根據(jù)本研究的結(jié)果,如果在硝酸鹽污染嚴(yán)重地區(qū),選擇農(nóng)田某一層位的土壤,利用微生物與秸稈進(jìn)行原位修復(fù)是可行的,既可在原位有效地修復(fù)土壤硝酸鹽污染,又能夠增加土壤的肥力,對(duì)修復(fù)污染和農(nóng)作物增產(chǎn)將會(huì)有益。

4 結(jié) 論

本研究利用反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1修復(fù)包氣帶土壤硝酸鹽污染,采用農(nóng)作物秸稈作為固體碳源為菌株提供能源與電子受體,取得了較好的試驗(yàn)效果,為農(nóng)作物秸稈的綜合利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(1)來(lái)源于巢湖濕地的反硝化菌株Klebsiella sp.DB-1能夠利用玉米、稻草、蘆葦和蒲葦秸稈作碳源,進(jìn)行生物反硝化去除土壤硝酸鹽,效果都較好,其中蒲葦為最佳,108 h時(shí)土壤中硝酸鹽氮的去除率達(dá)到94.4%。

(2)以蒲葦為碳源研究其用量對(duì)菌株反硝化結(jié)果的影響,結(jié)果表明每100 g土壤中5 g的蒲葦秸稈用量最佳,108 h時(shí)土壤硝酸鹽氮的去除率最大。

(3)針對(duì)土壤中硝酸鹽含量不同,菌株Klebsiella sp.DB-1的適應(yīng)性很強(qiáng),對(duì)土壤中較高含量初始硝酸鹽氮(如w初始硝酸鹽氮為200 mg/kg),具有較高的生物修復(fù)效率。

(4)土壤酸堿度(pH值)對(duì)反硝化作用的影響較大,土壤呈酸性會(huì)抑制菌株的反硝化活性,而土壤呈中性偏堿(pH值為7～9)時(shí),菌株的反硝化速率比較快,效果較好。

因此,利用反硝化細(xì)菌與農(nóng)作物秸稈進(jìn)行土壤硝酸鹽的原位生物修復(fù),不僅能夠迅速降低土壤硝酸鹽含量,還能夠有效阻止土壤過(guò)量的硝酸鹽對(duì)農(nóng)作物、蔬菜及地下水的污染,同時(shí),不會(huì)造成農(nóng)田的二次污染。

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