楊 健，張金霖，王清友，唐瑞文，王 俊，凌壽軍

（1.廣東煙草清遠市有限公司連州市分公司，廣東 連州 513400；2.廣東煙草清遠市有限公司，廣東 清遠 511515）

煙草病毒病是全世界煙草栽培地區(qū)發(fā)生普遍、危害嚴重的重要病害之一。近年來，煙草病毒病在我國各煙葉主產(chǎn)區(qū)有日趨加重的趨勢，嚴重影響煙葉產(chǎn)量和品質，已成為我國優(yōu)質煙葉生產(chǎn)的重要制約因素。煙草病毒病的病原種類多樣，國外已從煙草上分離到病毒32種，國內(nèi)報道發(fā)現(xiàn)18種[1]。其中，危害最為嚴重的病原種類主要有煙草普通花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）、馬鈴薯 Y 病毒（Potato Virus Y，PVY）、煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）等。田間調查顯示，當前煙草病毒病多混合發(fā)生，病害流行年份造成的損失可達30%～50%，早期發(fā)病的可達50%～70%，個別田塊甚至絕收，造成巨大的經(jīng)濟損失。在生產(chǎn)上，我國目前依舊缺乏煙草病毒病的廣譜高抗品種，抗源遺傳基礎狹窄以及品種結構單一。這不僅是近年來病毒病日趨嚴重的重要原因，還帶來病害大面積流行爆發(fā)的潛在危險。因此，如何篩選和創(chuàng)新優(yōu)質抗性種質資源，培育優(yōu)良抗病品種，從根本上防治煙草病毒病已顯得尤為重要。本文從煙草病毒病抗性種質資源的鑒定與培育，及其在煙草病毒病防治中的應用研究等方面進行了綜述，以期為煙草病毒病多抗品種的選育提供參考。

1 煙草病毒病抗性種質資源鑒定現(xiàn)狀

據(jù)不完全統(tǒng)計，國家煙草種質庫現(xiàn)已收集保存煙草野生種35份，烤煙品種1 104份，晾曬煙1 978份，白肋煙61份，黃花煙326份，以及雪茄煙3份[2]，其中不乏對煙草病毒病具有優(yōu)良抗性的品種。如何在眾多的種質資源中篩選鑒定出對病毒病具有廣譜高抗的材料，并用于抗病育種，是解決當前生產(chǎn)上主栽品種抗性基因單一所急需的手段。

近年來，我國煙草種質資源相關研究已取得了一定的進展，主要集中在煙草種質資源的收集、保存、分類鑒定[3－4]、遺傳多樣性分析[5]以及種質創(chuàng)新上[6－7]。其中，煙草病毒病抗性種質資源鑒定研究也有一定數(shù)量的報道。Gupton最初報道了一個栽培種Virgin突變體Virgin A Mutant（VAM）對PVY具有良好抗性[8]；陳榮平等[9]通過病圃發(fā)病情況調查和溫室接種鑒定，篩選到3份抗PVY材料，其中CV91在田間接種和溫室接種后都表現(xiàn)為高抗病性，可以作為很好的育種材料；另外，在2009年，陳榮平等[10]采用相同方法，對69份煙草種質資源進行篩選，初步鑒定出C151、Hawana10、壩林曬煙和Criollo salteno 11等11份表現(xiàn)為高抗PVY的煙草種質；而TN86、V.SCR、筑波2號也被報道是優(yōu)良的PVY抗源材料[6－11]。這些結果都表明，在已有的煙草種質中存在一定數(shù)量的PVY抗性種質資源，它們作為PVY抗性供體在PVY抗病改良中具有一定的應用價值。盡管如此，由于鑒定病原單一，沒有獲得這些種質其它病毒病的抗性指數(shù)信息，在病毒病多抗育種中依然存在一定的局限性。對此，戴培剛等選擇了1 000余份有代表性的煙草種質，對包括TMV、CMV、PVY等7個主要病害的抗性進行了鑒定分析[12]。在黃淮煙區(qū)供試品種中，TMV抗性資源較為豐富，高抗及免疫材料所占比例達到17.19%，中抗品種占18.76%；而CMV抗性種質缺乏，無高抗及免疫品種，中抗種質占20.70%，并主要分布在東北及西南煙區(qū)；另外，在41份烤煙品種中，鑒定的PVY抗性品種占14.63%，中抗比例為24.39%。在另一項研究中，劉艷華[4-5]等對202份煙草種質同樣進行了TMV、CMV、PVY3種病毒病的抗性鑒定，分別獲得抗TMV材料22份，抗CMV材料4份，以及抗PVY材料3份。這些研究結果為深入挖掘病毒病多抗種質提供了較為系統(tǒng)及全面的數(shù)據(jù)參考，同時也為煙草病毒病抗病品種培育奠定了基礎。

表1統(tǒng)計了部分種質資源對TMV、CMV、PVY的抗性情況。從統(tǒng)計結果可以看到，所有供試煙草種質中，對2個及以上病毒表現(xiàn)為抗性的品種很少，僅為10個；而對3種病毒都具備抗性的品種只有陽高小蘭花1個品種，且其對CMV及PVY只表現(xiàn)中等抗性。這些結果表明，一方面煙草病毒病廣譜抗性種質資源的相對缺乏，另一方面我國病毒病廣譜抗性種質的鑒定研究需要進一步深入，尤其是要加強對野生種及農(nóng)家種的抗源挖掘。這些種質經(jīng)長期自然進化及馴化后，往往具有較強的抗病、抗蟲及抗逆性狀，是廣譜抗病基因的天然寶庫，也是煙草多抗育種的重要基礎。

2 煙草病毒病抗性種質資源創(chuàng)新現(xiàn)狀

2.1 物理化學誘變的應用

在早期研究中，具有Virgin遺傳背景的VAM就是通過X-射線誘變得到的PVY高抗材料[8]，而VAM在抗PVY育種中也得到了實際應用。Gooding[13]等以VAM及Cokeer86為親本育成了PVY抗性品種NC744，并用于商業(yè)推廣。我國煙草誘變育種也已起步，相關研究人員對經(jīng)太空誘變的13個烤煙品種進行篩選，獲得了一系列突變材料，后期研究發(fā)現(xiàn)突變體后代的整體抗病性得到了顯著提高[14]。另外，離子注入技術等誘變方法在煙草種質創(chuàng)新中的應用也已見所報道[15]，這些突變體極大地豐富了我國煙草種質資源，在種質創(chuàng)新及誘變育種中具有廣闊的應用前景。

2.2 細胞工程的應用

煙草野生種與栽培種往往存在種間不親合現(xiàn)象，利用傳統(tǒng)育種方法很難實現(xiàn)野生種優(yōu)良性狀向栽培種的轉移。而細胞工程是克服種間不親合障礙、解決性狀轉移困難的有效手段，其中以體細胞雜交在煙草種質創(chuàng)新中的應用最多。目前，我國利用體細胞雜交技術創(chuàng)新煙草種質已取得相當進展。自70年代以來，我國先后成功誘導出普通煙草與8個野生煙草中的種間體細胞雜種。其中，普通煙草栽培品系86-1和N.nesophila的體細胞雜種株系，在接種TMV及CMV后表現(xiàn)枯斑反應，具備良好的病毒病抗性[16]；另外，孫學永等用G140與抗花葉病的野生波葉煙草N.undalate進行體細胞雜交，也得到了優(yōu)良TMV抗性的體細胞雜交單株自交系[17]。除此之外，利用組織培養(yǎng)中高頻率的細胞變異現(xiàn)象，篩選煙草抗性材料也有相關報道[18]。通過細胞工程手段，獲得的煙草抗性材料，不僅是煙草種質資源的重要來源，而且更多的是這些育種中間體作為新的煙草抗性種質資源在改良煙草病毒病抗性性狀上具有巨大的應用潛力。

2.3 轉基因技術的應用

自1986年Powell Abel將TMV外殼蛋白基因轉入煙草獲得第一例轉基因抗病毒植株以來[19]，利用現(xiàn)代生物技術獲得病毒病抗性植株，已成為煙草抗病種質資源創(chuàng)新的重要技術策略。我國利用生物技術培育抗病毒煙草起步較早，在90年代中期，我國科研人員就利用轉基因技術分別培育出CMV、

PVY抗性煙草植株[20－21]。之后，朱俊華等利用RNA沉默技術獲得RNA介導的PVY抗性煙草[22]；與之類似，顏培強等應用RNAi技術培育出高抗TMV的轉基因煙草植株[7]；進一步的研究利用RNA介導的轉錄后基因沉默現(xiàn)象，將一融合基因轉入受體，獲得了抗多種病毒病的轉基因煙草，研究結果顯示T1代轉基因植株兼具TMV、CMV、PVY的抗性，并且抗性性狀遺傳穩(wěn)定[23]。這些研究表明，轉基因技術不僅能突破自然界原本的種間隔閡，將其他物種的優(yōu)良病毒病抗病基因引入煙草種屬，重要的還是將其作為創(chuàng)新煙草病毒病抗性種質的有效手段，尤其在煙草種質庫中病毒病廣譜抗源普遍缺乏的情況下，利用多基因融合轉化技術能夠創(chuàng)造出新的多抗煙草材料，為煙草病毒病多抗育種提供更為多樣的材料選擇。

表1 部分煙草種質的主要病毒病抗性

3 前景與展望

培育煙草病毒病廣譜抗性品種是防治煙草病毒病流行，降低病害經(jīng)濟損失的根本手段，而煙草病毒病抗性種質的鑒定與創(chuàng)新是多抗育種的重要基礎。目前，盡管我國相關抗性鑒定研究取得一定進展，但所篩選到的病毒病抗性種質依舊較少，尤其是所鑒定的廣譜抗性種質極其缺乏，在生產(chǎn)上直接表現(xiàn)為抗病毒育種對病毒病防治的貢獻率較低。究其根源，這與對現(xiàn)有種質資源的挖掘和利用不夠有很大關系。因此，在今后一段時間內(nèi)，煙草病毒病抗性種質資源鑒定與創(chuàng)新研究應加強以下幾個方面：（1）充分利用我國豐富的煙草種質資源，擴大篩選范圍，尤其注重煙草野生種及農(nóng)家種的抗性評價，鑒定出更多的廣譜抗性種質，并對部分重點種質做到精準鑒定，篩選出多抗育種的骨干親本；（2）利用現(xiàn)代生物技術，充分發(fā)揮分子標記等手段在種質遺傳多樣性、抗性鑒定以及優(yōu)質基因挖掘上的優(yōu)勢，不斷提高病毒病抗性鑒定效率；（3）加大煙草病毒病抗性種質創(chuàng)新力度，充分發(fā)揮細胞工程及轉基因技術在克服種間障礙中的優(yōu)勢，實現(xiàn)優(yōu)良抗病性狀的轉移，不斷豐富病毒病抗性遺傳基礎；（4）注重現(xiàn)代生物技術與傳統(tǒng)育種的結合，提高育種效率，加快優(yōu)良抗性性狀的應用步伐。

[1]李 凡，陳海如.引起煙草病害的病毒種類研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報，2001，16（2）：160-166.

[2]任 民，王志德，牟建民，等.我國煙草種質資源的種類與分布概況[J].中國煙草科學，2009，30（增刊）：8-14。

[3]李文平，朱列書，趙松義.煙草種質資源部分性狀的相關、通徑及聚類分析[J].中國煙草科學，2009，30（增刊）：59-63.

[4]劉艷華，王志德，錢玉梅，等.煙草抗病毒病種質資源的鑒定與評價[J].中國煙草科學，2007，28（5）：1-4.

[5]劉建豐，王志德，劉艷華，等.應用SRAP標記研究煙草種質資源的遺傳多樣性[J].中國煙草科學，2007，28（5）：49-53.

[6]劉鳳蘭，段旺軍，王素琴，等.離子注入技術及其在煙草育種上的應用研究[J].種子，2004，23（12）：58-60.

[7]顏培強，白先權，萬秀清，等.應用RNAi技術培育抗TMV病毒轉基因煙草[J].遺傳，2007，29（8）：11018-1022.

[8]Gupton C L,Burk L G.Location of the factor for resistance to potato virus Y in tobacco[J].Heredity,1973，64：289-290.

[9]陳榮平，馮春才.煙草抗PVY育種材料的篩選與應用[J].中國煙草科學，2000，21（1）：1-4.

[10]陳榮平，馮春才，王春軍，等.部分煙草種質資源的PVY抗性鑒定[J].中國煙草科學，2009，30（增刊）：56-58.

[11]周顯升，錢玉梅，陳德鑫，等.煙草品種對馬鈴薯Y病毒抗性遺傳分析[J].中國煙草學報，1997，13（1）：31-36。

[12]戴培剛，王志德，牟建民，等.部分煙草種質主要病害抗性分析[J].中國煙草科學，2004（3）：1-5.

[13]Gooding G V,Kennedy G G.Resistance in tobacco breeding line NC744 to potato virus Y and inoculation by aphids[J].Plant Disease,1985,69：396-397.

[14]董志堅，董順德，趙獻章，等.空間誘變育種技術及其在煙草上的研究前景[J].中國煙草學報，2005，11（2）：35-39.

[15]孫 煥，劉鳳蘭，王素琴.烤煙雄性不育雜交種制種技術[J].中國種業(yè)，2006，（11）：12-15.

[16]孫玉合，丁昌敏，張歷歷，等.煙草種間體細胞雜交及其在育種上的應用[J].中國煙草科學，1998（4）：5-8。

[17]孫學永，林國平，殷鳳生，等.煙草體細胞雜交優(yōu)質抗病株系的選育[J].煙草科技，2003（7）：36-40.

[18]彭劍濤，向 結.利用組織培養(yǎng)技術獲得煙草抗性材料的研究[J].種子，2002，（3）：26-27.

[19]Powell A P,Nelson R S,De B,et al.Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene[J].Science,1986,232:738-743.

[20]吳中心，張同慶，姚根懷，等.快速選育抗黃瓜花葉病毒的轉基因煙草純合品系[J].中國煙草，1994，（3）：1-7。

[21]王振東，劉玉東.馬鈴薯Y病毒復制酶基因植物表達載體構建及轉基因煙草的培育 [J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，1995，26（3）：249-253.

[22]朱俊華，朱常香，溫孚江，等.正向和反向重復RNA介導的抗馬鈴薯Y病毒基因工程比較研究 [J].植物病理學報，2004，34（2）：133-140.

[23]朱常香，宋云枝，溫孚江.多抗PVY、TMV和CMV轉基因煙草的培育[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（4）：1040-1047.