李海芳 浦 永 湯石明 強(qiáng) 冉 湯 華

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院天津市生命科學(xué)中心實驗室,天津300070)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

人Argonaute2蛋白多克隆抗體制備及初步應(yīng)用①

李海芳 浦 永 湯石明 強(qiáng) 冉 湯 華

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院天津市生命科學(xué)中心實驗室,天津300070)

目的:制備人Argonaute2(Ago2)的多克隆抗體,鑒定其特異性,并應(yīng)用該抗體檢測Ago2在人各細(xì)胞系中的表達(dá)差異及細(xì)胞定位。方法:用DNAstar軟件尋找抗原性高的Ago2序列區(qū)域(命名為k-Ago2),構(gòu)建k-Ago2的表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌并誘導(dǎo)表達(dá)。融合蛋白經(jīng)切膠回收純化后免疫大白兔制備抗體。以ELISA檢測抗體效價,Western blot鑒定抗體特異性及檢測Ago2在細(xì)胞系中的表達(dá)差異,免疫熒光染色觀察Ago2的細(xì)胞定位。結(jié)果:成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒,繼而k-Ago2得以表達(dá)與純化,免疫大白兔后得到Ago2多克隆抗體。ELISA檢測抗體效價為1∶19 000,Western blot確定抗體具有高度特異性,并成功地用該抗體檢測到Ago2在人各細(xì)胞系中的表達(dá)差異及細(xì)胞定位。結(jié)論:Ago2多克隆抗體的成功制備,對RNAi機(jī)制的深入研究及其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用均具有重要價值。

Argonaute2蛋白;多克隆抗體;RNA干擾;RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體

[Abstract]NA干擾(RNA interference,RNAi)是由小RNAs介導(dǎo),在幾乎所有真核生物中存在的保守的基因調(diào)節(jié)機(jī)制[1-3],可以使同源靶mRNA降解或者翻譯抑制進(jìn)而使基因表達(dá)抑制或沉默[4],在生物體抗病毒感染、腫瘤發(fā)生、生物發(fā)生發(fā)育時序的控制、脂肪代謝、血細(xì)胞分化、細(xì)胞生長和凋亡等過程中發(fā)揮著重要的作用[5]。在RNAi過程中,小RNAs與Argonaute (AG O)蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC),并引導(dǎo)RISC識別互補(bǔ)的靶序列引發(fā)不同的沉默效應(yīng),而其中AG O蛋白是RISC的核心部分[6,7]。并且實驗報道顯示只有Ago2蛋白是人類AG O蛋白家族(Ago1-4)中已知的唯一在RNAi起作用的成員,它與小RNAs即可構(gòu)成最簡單的效應(yīng)器對完全互補(bǔ)的靶mRNA進(jìn)行剪切[8-10]。因此,在哺乳動物的RNAi中,Ago2是特異的并具有非常重要的作用[11]。本研究尋找抗原性強(qiáng)的Ago2蛋白片段進(jìn)行原核表達(dá)、純化、成功制備Ago2抗體并以該抗體進(jìn)行了初步應(yīng)用,為進(jìn)一步深入了解RNAi參與人類諸多疾病的基本生物學(xué)機(jī)制及RNAi在臨床上的應(yīng)用起到了基礎(chǔ)性作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Argonaute2蛋白全長表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3 myc/Ago2,原核表達(dá)載體pRSET A2(由本實驗室在pRSETA基礎(chǔ)上改建而成,將EcoRⅠ和XhoⅠ位點調(diào)換),大腸桿菌X L1-Blue、BL21(DE3),所用細(xì)胞系均由本實驗室保存。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成;測序由北京華大基因提供;Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker購自Ferments公司;各種限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司;弗氏完全佐劑(FCA)及弗氏不完全佐劑(FICA)購自Sigma公司;DNA marker、日本大耳白兔、抗His抗體、抗myc抗體、抗 G APDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自賽爾生物科技有限公司;異硫氰酸(FITC)標(biāo)記的驢抗兔IgG購自Jackson Immunoresearch Laboratories。其他所用化學(xué)試劑均為分析純以上產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR回收產(chǎn)物和pRSETA2空載體以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切,37℃水浴過夜后,進(jìn)行瓊脂糖(10 g/L)凝膠電泳并回收,然后在T4 DNA連接酶作用下室溫連接4小時,轉(zhuǎn)化E.coliX L1-Blue,通過氨芐青霉素(Amp+)抗性篩選得到重組子。挑取陽性克隆小提質(zhì)粒DNA并酶切鑒定。

1.2.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coliBL21(DE3),涂布于Amp+抗性的LB平板37℃過夜培養(yǎng)。然后挑取單克隆于2 ml LB中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日接種培養(yǎng)物到10 ml LB中, 37℃振蕩培養(yǎng)約2小時,至A600=0.5～0.7。取1 ml作為誘導(dǎo)前對照,其余的加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L,30℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4小時。離心收集菌體,其中誘導(dǎo)后菌體加入磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸后超聲裂解,離心取上清,在其沉淀即重組蛋白形成的包涵體中加入Buffer B(100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L Tris·Cl,8 mol/L urea,pH8.0)裂解,再次離心取上清。誘導(dǎo)前對照組菌體則直接加入Buffer B裂解后離心取上清。將各管上清取部分加入上樣緩沖液水浴煮沸5分鐘,冰置5分鐘進(jìn)行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色分析。

1.2.4 融合蛋白的切膠回收純化 將表達(dá)融合蛋白的菌液轉(zhuǎn)接到150 ml LB中擴(kuò)大培養(yǎng),并按上述條件誘導(dǎo)表達(dá)和裂解菌體。將包涵體裂解所得上清加入上樣緩沖液處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,根據(jù)溴酚藍(lán)位置推測目的蛋白位置。結(jié)束電泳后,將膠放入0.25 mol/L KCl溶液中在搖床上搖動約15分鐘,目的蛋白可呈現(xiàn)一條白色的條帶,將條帶切下后裝入密封的透析袋(內(nèi)裝滿PBS),以1×Tris-甘氨酸(不含SDS)緩沖液為電泳液進(jìn)行水平電泳。120 mA恒流電泳2小時后對換陰陽極后再電泳3分鐘,然后留取透析袋內(nèi)的PBS緩沖液并取部分上樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 兔多克隆抗體的制備 取200μg蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1比例混合后皮下注射初次免疫兔子,以后每間隔2周,取200μg蛋白與弗氏不完全佐劑按1∶1比例混合加強(qiáng)免疫2次,1周后兔耳緣靜脈取血檢測抗體效價并加強(qiáng)免疫1次,如達(dá)到所需效價7天后取全血,分離血清后,無菌分裝保存于-20℃。

1.2.6 間接ELISA法檢測抗體效價 以終濃度為1 mg/L的目的蛋白包被ELISA反應(yīng)孔,一抗是作為空白對照的PBS、陰性對照的免疫前兔血清以及倍比稀釋的抗目的蛋白抗體,二抗為HRP-羊抗兔IgG (1∶20 000),最后加入底物顯色后,用酶標(biāo)儀測定A450的值。結(jié)果以實驗組值-空白對照/陰性對照-空白對照≥2.5為陽性,以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋度作為抗體的效價。

1.2.7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書推薦的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞,置37℃, 5%CO2孵箱培養(yǎng)48小時后進(jìn)行細(xì)胞裂解。

1.2.8 Western blot SDS-PAGE電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)(4℃,恒流300 mA,2小時)到硝酸纖維素膜(NC)上,然后將NC膜在含50 g/L脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2小時后,加抗目的蛋白的抗體(1∶600)室溫作用2小時,TBST洗去未結(jié)合一抗,再加HRP-羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)室溫作用1小時,TBST洗去未結(jié)合二抗,加底物反應(yīng)3分鐘后暗室曝光并觀察結(jié)果。

1.2.9 免疫熒光染色 將細(xì)胞接種于14孔板中,細(xì)胞密度為2 000～3 000/孔,37℃孵育過夜。24小時后加40 g/L多聚甲醛4℃作用30分鐘固定細(xì)胞,再加入5 ml/L TritonX-100,4℃通透化處理20分鐘。然后加100 ml/L驢血清封閉1小時后,加抗目的蛋白的抗體(1∶50)4℃作用過夜。次日加FITC-驢抗兔IgG二抗(1∶200)4℃作用1小時,再加DAPI 4℃染色5分鐘,最后加封片劑,熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒

2.1.1 PCR擴(kuò)增目的片段 經(jīng)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,瓊脂糖凝膠電泳可得到609 bp的目的條帶(圖1A)。

2.1.2 驗證原核表達(dá)質(zhì)粒 重組質(zhì)粒pRSET A2-k-Ago2經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后出現(xiàn)609 bp的目的條帶,與預(yù)期結(jié)果一致(圖1B)。將酶切鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序,測序結(jié)果用NCBI的BLAST程序分析,結(jié)果表明,獲得的k-Ago2編碼序列與預(yù)期的Ago2序列區(qū)域一致,且在原核表達(dá)載體中的連接方向和閱讀框架正確,說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 k-Ago2蛋白的表達(dá)和純化

圖1 原核表達(dá)質(zhì)粒pRSET A2-k-Ago2的構(gòu)建Fig.1 Construction of prokaryotic expressed plasmid pRSET A2-k-Ago2

2.2.1 鑒定誘導(dǎo)表達(dá)的k-Ago2蛋白 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色在分子量約34 kD處可見一明顯蛋白誘導(dǎo)條帶,說明k-Ago2蛋白在BL21(DE3)菌株中得以表達(dá),且主要以包涵體的形式存在(圖2)。

2.2.2 融合蛋白的切膠回收純化 鑒于融合蛋白大量表達(dá)形成包涵體,故對包涵體裂解液進(jìn)行切膠回收純化,KCl染色時可見兩條白色條帶,均回收進(jìn)行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色分析(圖3A),并以抗His抗體進(jìn)行Western blot檢測區(qū)分(圖3B)。結(jié)果顯示目的蛋白得到了高度純化,純度達(dá)100%,經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA標(biāo)化后濃度約為0.8 g/L,可以用作免疫原。

2.3 抗體效價的檢測 通過間接ELISA法進(jìn)行檢測后,抗體效價可達(dá)到1∶19 000,而作為陰性對照的免疫前兔血清顯色呈陰性。

圖2 k-Ago2融合蛋白表達(dá)的確定Fig.2 Determination of k-Ago2 fusion protein expression

圖3 檢測切膠回收純化后的k-Ago2融合蛋白Fig.3 Detection of k-Ago2 fusion protein after purification by gel regaining

2.4 抗體特異性的分析 (1)用純化的k-Ago2蛋白免疫日本大耳白兔后得到兔抗人k-Ago2抗體,以誘導(dǎo)后大腸桿菌檢測k-Ago2抗體,Western blot分析顯示此抗體可特異性與大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)所產(chǎn)生的k-Ago2蛋白結(jié)合,與菌體其他成分無交叉反應(yīng)(圖4A)。(2)以所制備k-Ago2抗體在HEK293細(xì)胞裂解液中進(jìn)行Western blot檢測,結(jié)果可見分子量約97 kD處有一明顯條帶,與文獻(xiàn)報道的Ago2蛋白大小相符,為特異的內(nèi)源性Ago2蛋白條帶,無明顯非特異條帶,表明該抗體對Ago2蛋白有極高的特異性(圖4B)。(3)以pCDNA3 myc/Ago2表達(dá)載體及pCDNA3 myc空載體轉(zhuǎn)染 HEK 293獲取細(xì)胞蛋白裂解液,以抗myc抗體及k-Ago2抗體做Western blot,結(jié)果抗myc組顯示外源質(zhì)粒pCDNA3 myc/Ago2得以表達(dá),k-Ago2抗體組均可見97 kD的目的條帶,且轉(zhuǎn)染pCDNA3 myc/Ago2組蛋白量明顯高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染空載體對照組,表明該蛋白片段所得抗體可特異性識別外源性及內(nèi)源性Ago2蛋白(圖4C)。

2.5 抗體的初步應(yīng)用

2.5.1 檢測Ago2蛋白在細(xì)胞系中的表達(dá)差異 收集人類細(xì)胞系胚腎細(xì)胞HEK293、喉癌Hep2、乳腺癌MCF-7、宮頸癌HeLa、紅白血病細(xì)胞K562、正常肝細(xì)胞LO2、原發(fā)性肝癌QGY-7703、胃癌MGC-803細(xì)胞裂解物,采用Western blot均可檢測到大小正確的目的條帶,可以觀察到不同細(xì)胞系中Ago2蛋白的表達(dá)差異(圖5A)。

圖4 Western blot分析抗體的特異性Fig.4 Analysis of the specificity of the antibody by Western blot

圖5 多克隆抗體對Ago2蛋白的識別Fig.5 Identification of Ago2 protein by polyclonal antibodies

2.5.2 檢測Ago2蛋白的細(xì)胞定位 在 HeLa及QGY-7703細(xì)胞中,免疫熒光染色顯示Ago2蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖5B)。

3 討論

自1990年基因轉(zhuǎn)錄后沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)拉開了RNAi的帷幕后,對RNAi技術(shù)的研究便成為科研的焦點。至今日,RNAi技術(shù)因具有高效沉默特定靶基因的特點而成為一門新興的基因阻斷技術(shù),在病毒感染、腫瘤、移植免疫等疾病的治療上展現(xiàn)出了誘人的廣闊前景。但RNAi作用的確切機(jī)制卻仍未得以完全的認(rèn)識。目前已知,在人類RNAi的過程中,RISC的形成及其發(fā)揮作用的過程是RNAi的效應(yīng)步驟而Ago2蛋白是RISC中具有剪切活性的剪切體(Slicer)[11],在RNAi過程中起到了至關(guān)重要的作用。

人類Ago2蛋白全長約97 kD,在原核系統(tǒng)進(jìn)行全長表達(dá)較困難,故本實驗采用DNAstar軟件對人類Ago2基因編碼區(qū)進(jìn)行分析,尋找疏水性弱、抗原性強(qiáng)且位于蛋白質(zhì)表面可能性高的區(qū)域,對該區(qū)域進(jìn)行原核表達(dá),純化及制備抗體。此法以融合蛋白作為抗原可使蛋白質(zhì)的純化變得容易,且制備抗體時有較高的免疫原性,所制備抗體特異性高,可以有效地避免人類AG O蛋白家族之間的抗原交叉性。

一般地,His融合蛋白可經(jīng)由Ni2+-NTA樹脂進(jìn)行純化。但實際操作顯示,融合蛋白在經(jīng)Ni2+-NTA樹脂純化洗脫后仍有少數(shù)非特異條帶存在?；谠摰鞍状罅勘磉_(dá)存在于包涵體中,在此選擇了切膠回收純化的方式。該方法經(jīng)濟(jì)、快速、操作簡便、純化后蛋白純度極高,完全符合制備抗血清的要求,其缺陷在于蛋白染色時出現(xiàn)的為白色條帶,無法明確所有目的蛋白所在位置。但以純化抗原免疫家兔后,得到的抗血清效價很高,且Western blot結(jié)果說明該抗體可以與原核表達(dá)的k-Ago2及真核表達(dá)系統(tǒng)中內(nèi)源性和外源性Ago2蛋白發(fā)生特異反應(yīng),說明Ago2抗體制備成功。

總之,在本實驗中,對人類Ago2片段進(jìn)行原核表達(dá),純化,成功制備了特異性極高的人類Ago2抗體,這不僅驗證了蛋白切膠回收純化制備蛋白抗原的可行性,更重要的是,該抗體成功檢測各細(xì)胞系中Ago2的表達(dá)差異及在細(xì)胞中的Ago2定位,這為RNAi機(jī)制的進(jìn)一步深入研究提供了重要工具,為RNAi技術(shù)在多種疾病中展開基因治療起到了奠基作用。

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[收稿2009-10-12 修回2009-11-24]

(編輯 許四平)

Generation and preliminary application of polyclonal antibodies against human Argonaute2

LI Hai-Fang,PU Yong,TANGShi-Ming,QIANG Ran,TANG Hua.Tianjin Life Science Research Center and Basic Medical School,Tianjin Medical University,Tianjin300070,China

Objective:T o generate rabbit polyclonal antibody against human Argonaute2(Ago2)protein and to identify its functional characterization for determinationof differential expression and cellular localizationof Ago2 protein in various cell lines.Methods:DNAstar software was appliedfor searching the high antigenicity regionof Ago2 gene sequence termed k-Ago2.Prokaryotic expressingplasmid was constructed and transformed toE.coliBL21(DE3)to induce expression by IPTG.The fusion protein was injected into rabbits subcutaneously to produce polyclonal antibodies after purification by gel regaining.ELISA was operated to detect antibody titer.Western blot was used to identify the specificity and sensitivity of the antibodies and detect the differential expression of Ago2 protein in various cell lines.Meanwhile,immunofluorescence experiments were arranged to show cellular localization of Ago2 protein.Results:The prokaryotic expressing plasmid was constructed correctly.K-Ago2 protein was expressed and purified,and then rabbit polyclonal antibodies against Ago2 were generated after immunization with k-Ago2 protein.The titer detected by ELISA was 1∶19 000.Western blot results demonstrated the high specificity of the antibodies.Finally,we successfully observed the differential expression and cellular localization of Ago2 protein in various cell lines.Conclusion:The polyclonal antibody against Ago2 protein has been achieved successfully.It will be propitiousfor the intensive studyof the RNAi mechanism and even profound clinical application.

Argonaute2 protein;Polyclonal antibodies;RNA interference;RNA-induced silencing complex

Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)03-0241-05

①本文為國家自然科學(xué)基金項目(No.30873017)、天津市自然科學(xué)基金重點項目(No.08JCZDJC23300,No.09JCZDJC17500)

李海芳(1983年-),女,在讀碩士,主要從事病毒學(xué)與分子生物學(xué)及小RNA與疾病的研究,E-mail:felice-sea@163. com;

及指導(dǎo)教師:湯 華(1963年-),男,博士生導(dǎo)師,主要從事病毒學(xué)與分子生物學(xué)及小RNA與疾病的研究,E-mail:htang2002@yahoo.com。