馬麗娟,王婷婷

(寧夏大學化學化工學院,寧夏銀川66865380)

麥冬多糖提取工藝的研究*

馬麗娟,王婷婷

(寧夏大學化學化工學院,寧夏銀川66865380)

以麥冬總多糖百分含量為指標,采用正交設計對用熱水浸提醇沉法提取麥冬多糖的工藝條件進行了優(yōu)選研究。在提取過程中,根據(jù)單因素實驗確定了醇沉時乙醇的用量為濃縮液體積的5倍,含量測定時的最佳顯色時間為15min;設計L9(33)正交實驗,利用苯酚-硫酸法進行含量測定,重點考察加水量、提取溫度和提取次數(shù)對提取效果的影響。結果顯示提取麥冬多糖的優(yōu)選工藝條件為加12倍量水,70℃水浴,提取3次,總多糖含量為67.83%。

麥冬多糖;正交試驗;提取工藝;含量測定

麥冬(Ophiopogon japonicus)首載于《神農本草經》,系百合科沿階草屬多年生常綠草本植物麥冬的塊根,在我國大部分地區(qū)均有野生分布和栽培,其著名產地有四川三臺(川麥冬)和浙江杭州(杭麥冬)。麥冬主要化學成分為甾體皂甙、多糖、高異黃酮類、氨基酸等[1]。

麥冬多糖是從麥冬塊根中提取的,總多糖由葡萄糖、果糖兩種單糖組成。近年來的麥冬多糖藥理作用的研究表明,作為麥冬的主要成分之一,麥冬多糖具多種藥效,如具有抗心律失常,促使胰島細胞的恢復,促進抗體、補體、溶菌酶等的產生等作用[2]。長期以來,麥冬多糖作為滋陰類中藥在臨床上得到廣泛使用,其具有的多種藥理活性已經引起人們的廣泛興趣和關注。麥冬多糖的提取工藝已有較多的研究,目前多采用的方法是用95%乙醇或甲醇加熱回流提取以除去單糖、低聚糖及脂溶性成分,后加水提取其中的多糖類成分。

本實驗以麥冬多糖百分含量為指標,采用熱水浸提醇沉法提取麥冬多糖,設計L9(33)正交實驗,根據(jù)苯酚-硫酸法[3]對其進行含量測定,重點考察加水量、提取溫度和提取次數(shù)對提取效果的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 麥冬:購于寧夏銀川市西夏區(qū)同心路寧和醫(yī)院。

1.1.2 試劑葡萄糖標準品:西安化試劑廠

苯酚(分析純):萊陽市雙雙化工廠;

濃硫酸(分析純):無錫市展望化工試劑有限公司

1.1.3 儀器植物粉碎機:天津市泰斯特儀器有限公司,型號FZ102;

數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司,HH-2型;

水循環(huán)式多用真空抽濾機:鄭州長城科工貿有限公司;

721 分光光度計:上海第一分析儀器廠;

干燥箱;電子天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

將麥冬藥材置于60℃干燥箱中烘干,使用植物粉碎機將其進行粉碎,密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 麥冬多糖含量的測定

參照文獻使用苯酚-硫酸法測定多糖含量。此法是先用葡萄糖制作標準曲線后,再通過多糖顯色反應測定吸光度,然后根據(jù)其在曲線上的位置推算出多糖的濃度從而推算其含量。

1.2.2.1 標準溶液的配制

稱取葡萄糖標準品0.041g,用蒸餾水將其溶解定容到100mL容量瓶中,混勻。分別精密量取該葡萄糖溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL至10mL容量瓶中,加水定容得到標準葡萄糖溶液。

表1 最大吸收波長的測定

1.2.2.2 6%苯酚水溶液的配制

稱取苯酚50.0g,加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g,蒸餾,準確稱取178℃餾分時的苯酚9g,加水150mL溶解,配成6%苯酚水溶液。置棕色瓶中保存,備用[4]。

1.2.2.3 標準曲線的繪制

量取上述2號標準葡萄糖溶液2.0mL置于干燥燒杯中,加入6%苯酚溶液1.0mL搖勻,然后加入濃硫酸5.0mL搖勻,另取上述1號2.0mL同法操作作為空白對照,于沸水浴中顯色15min,取出自然冷卻至室溫,利用721分光光度計,在450530nm之間測定吸光度,結果在492nm處有最大吸收,因此選擇測定波長為492nm。見表1。

分別移取上述標準溶液2.0mL于干燥燒杯中,分別加入1.0mL 6%苯酚溶液和5.0mL濃硫酸,搖勻。于沸水浴中恒溫顯色15min,自然冷卻至室溫,以1號為空白對照,在492nm波長處測定吸光度。以吸光度對濃度作工作曲線,得到線性方程:A=0.05757+0.01308C。見圖1。

1.2.2.4 單因素實驗

醇沉乙醇用量的影響 稱取經粉碎的麥冬2g四份,各加入10倍量水,于70℃水浴中浸提60min,取出抽濾,濾液濃縮至10mL,分別加入95%乙醇40、50、60、70mL,靜置醇沉3h。棄去上清夜,將沉淀置于 60℃烘箱中干燥 30min,取出加水溶解,于250mL容量瓶中定容,再移取1mL于另一250mL容量瓶中稀釋至刻度。按標準曲線繪制項下方法測定其吸光度并計算多糖含量,結果見表2。

圖1 葡萄糖標準曲線

表2 乙醇用量的影響

顯色時間的確定稱取經粉碎的麥冬2g四份,各加入10倍量水,于70℃水浴中浸提60min,取出抽濾,濾液濃縮至10mL,加入95%乙醇50mL,靜置醇沉3h。棄去清夜,將沉淀置于60℃烘箱中干燥30min,取出加水溶解,于250mL容量瓶中定容,再移取1mL于另一250mL容量瓶中稀釋至刻度。各移取2.0mL分別置于干燥燒杯中,依次加入1mL6%苯酚和5mL濃硫酸,搖勻并分別置于沸水浴中顯色5、10、15、20min,自然冷卻至室溫,492nm波長下測定其吸光度并計算含量如表3。

表3 顯色時間的影響

1.2.3 正交實驗設計

選取加水量(A)、提取溫度(B)、提取次數(shù)(C)作為考察因素,每個因素擬定3個水平,見表2-4,選用L9(33)正交表,實驗安排見表5。

表4 因素水平表

表5 L9(33)正交設計表

1.2.3.1 多糖的提取

用天平稱取9份2g粒度均勻的麥冬,分別按正交實驗設計表(表2-5)的安排進行實驗,實驗過程中,根據(jù)單因素實驗的結果,各實驗項下的提取液均濃縮到10mL,醇沉乙醇用量為50mL,顯色時間為15min。

1.2.3.2 含量測定

移取樣品2.0mL按標準曲線繪制項下步驟操作,測定吸光度,以標準曲線計算麥冬多糖含量,結果見表6。

表6 正交實驗結果

實驗號 因素A B C 吸光度 麥冬總多糖含量(%) 麥冬用量(g) 6 2 3 1 0.255 47.12 2.002 7 3 1 3 0.350 67.83 2.060 8 3 2 1 0.330 64.13 2.030 9 3 3 2 0.282 51.36 2.088 K1 52.49 58.32 55.63 K2 51.05 55.58 50.30 K3 61.11 50.75 58.72 R 10.05 7.57 8.42

K1一水平試驗結果總和的平均值

K2二水平試驗結果總和的平均值

K3三水平試驗結果總和的平均值

R:極差,反映了同一因素取不同水平時,試驗結果的變化幅度,變化幅度越大,說明該因素對試驗結果的影響越大,它就越重要。

以上正交試驗結果表明,各因素對試驗結果影響的程度依次為:A>C>B,即加水量>提取次數(shù)>提取溫度。綜合各種因素考慮,確定最優(yōu)工藝條件為A3B1C3。

1.2.3.3 追加驗證試驗結果

1.2.3.3.1 重現(xiàn)性實驗

精密量取2.0mL正交試驗中7號樣品溶液5份,按含量測定方法依法獨立測定樣品含量,以考察本法的重現(xiàn)性,見表7。測定的平均值結果為67.87%,RSD為0.288%。

表7 重現(xiàn)性實驗

1.2.3.3.2 工藝條件驗證實驗

稱取2.0g麥冬藥材5份,分別加12倍量水,于70℃水浴中提取3次,每次30min,合并各份提取液并濃縮至10mL,分別加入95%乙醇50mL靜置醇析,取沉淀于60℃烘箱中烘干,按照優(yōu)選方案項下溶解并稀釋,根據(jù)含量測定方法依次測定,其結果見表8。測得多糖得率平均值為67.55%,RSD為0.292%,表明該工藝穩(wěn)定可靠。

表8 工藝驗證

1.2.3.3.3 穩(wěn)定性實驗

取工藝驗證試驗中5號樣品溶液2mL,按照含量測定方法操作,每隔20min測一次光度,其結果見表9,RSD為1.01%,表明測定值在120min內保持穩(wěn)定。

表9 穩(wěn)定性實驗

1.2.3.3.4 加樣回收實驗

1.稱取2.0g麥冬按照工藝驗證步驟操作,測得吸光度為0.35,計算得第一次定容的濃度為5589.26μg/mL。

2.待加葡萄糖溶液 稱取0.6g葡萄糖于燒杯中溶解,轉移至100mL容量瓶中定容至刻度,搖勻備用。

3.量取第一次定容的麥冬多糖溶液0.5mL于250mL容量瓶中,加入0.5mL上述葡萄糖溶液,加蒸餾水至刻度搖勻。取5個燒杯,分別移入2mL此溶液,依法測定其吸光度,計算回收率見表10。結果均值為96.72%,RSD為2.31%。

表10 回收率實驗

結果分析:在同等條件下,追加驗證試驗的多糖含量均無明顯差異.因此優(yōu)選的麥冬多糖的提取工藝條件為最佳工藝.

2 討論

本研究主要是采用正交實驗分析結果,正交實驗是研究多因素、多水平的一種設計方法,它能夠在因素變化范圍內均衡抽樣,并且使每次實驗都具有較強的代表性。正是由于正交實驗具備均衡分散的特點,所以保證了全面實驗的某些要求,而這些實驗往往能夠較好或更好的達到實驗目的。換句話說,只需采用較少的實驗次數(shù),即可獲得最佳的方案。

據(jù)文獻報道,苯酚-硫酸比色法和蒽酮-硫酸比色法為多糖含量測定的兩種經典的方法。由于苯酚相對價廉,且苯酚液配制以后只要放在冰箱冷藏起來,一般不會影響測定結果[5]。故選用苯酚-硫酸比色法作為麥冬多糖的含量測定方法。

本實驗優(yōu)選出的麥冬多糖提取工藝條件為加12倍量水,70℃水浴,提取3次,總多糖含量為67.83%。該工藝操作簡單,經濟可行,為麥冬多糖熱水浸提醇沉工藝的選擇提供了參考。

[1]范俊,張旭.麥冬多糖藥理研究進展[J].中醫(yī)藥學刊,2006,24(4):626-627.

[2]齊建紅,陶貴榮,郭新軍等.麥冬多糖的生物活性研究進展[J].西安文理學院學報:自然科學版,2008,11(1):44-46.

[3]馮怡,韓寧,徐德生等.麥冬多糖含量測定方法的研究[J].中成藥,2006,28(5):705-707.

[4]王桂玲,房建強,趙雪梅等.麥冬多糖水提醇沉工藝研究[J].泰山醫(yī)學院學報,2007,28(8): 603-605.

[5]呂麗娟,馬明輝,貢濟宇等.正交實驗法優(yōu)選麥冬多糖提取工藝[J].長春中醫(yī)藥大學學報, 2007,23(2):30-31.

[責任審校:秦春娥]

R944.1

A

1672-1047(2010)04-0026-05

10.3969/j.issn.1672-1047.2010.04.07

2010-05-27

馬麗娟,女,副教授。E-mail:malj@nxu.edu.cn.