王身艷，潘揚(yáng)，蔣亞平，唐海霞，陳建偉（南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京市 210029）

雙向發(fā)酵對川烏指紋圖譜及烏頭堿類成分含量的影響Δ

王身艷＊，潘揚(yáng)，蔣亞平，唐海霞，陳建偉#（南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京市 210029）

目的：觀察川烏被19種藥用真菌發(fā)酵后，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量的變化及高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的差異。方法：將川烏作為“藥性基質(zhì)”，在一定的條件控制下，應(yīng)用雙向發(fā)酵技術(shù)，使其被槐耳、靈芝、紅栓等19種藥用真菌發(fā)酵，產(chǎn)生藥材的“藥性菌質(zhì)”，并采用反相高效液相色譜法對“藥性菌質(zhì)”和生藥材中所含的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿進(jìn)行含量測定，比較其含量的變化及指紋圖譜的差異。結(jié)果：在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，大多數(shù)的菌株在川烏基質(zhì)上的適應(yīng)性良好，菌絲體生長旺盛，如代號A、C、D、E、F、M、Q、V、SW、い等真菌。發(fā)酵之后的川烏中烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿含量與生藥材比較多數(shù)有明顯的降低。結(jié)論：雙向發(fā)酵后多數(shù)“藥性菌質(zhì)”中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿含量明顯降低了，提示雙向發(fā)酵是生物技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用的有益嘗試。

川烏；烏頭堿；新烏頭堿；次烏頭堿；生物轉(zhuǎn)化；反相高效液相色譜法

Δ南京中醫(yī)藥大學(xué)科技項(xiàng)目（09XZR18）

＊講師，博士研究生。研究方向：有毒中藥的生物轉(zhuǎn)化。E-mail：wsy741120@yahoo.com.cn

#通訊作者：教授。研究方向：中藥資源學(xué)。電話：025-85811659

雙向固體發(fā)酵是南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究中心莊毅教授于20世紀(jì)80年代創(chuàng)立的一種新型中藥發(fā)酵技術(shù)，它用具有活性成分的中藥作為藥性基質(zhì)，被藥用真菌發(fā)酵，產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生理活動(dòng)和生化效應(yīng)，從而產(chǎn)生新的活性成分和新的功能，無需將藥用真菌與次級代謝產(chǎn)物分離，二者共同使用，協(xié)同發(fā)揮藥效[1]。中藥發(fā)酵的目的主要是為了增強(qiáng)藥效、發(fā)現(xiàn)新的治療作用、減毒解毒、擴(kuò)大用藥品種等。如潘揚(yáng)等[2]采用藥用真菌對馬錢子進(jìn)行雙向發(fā)酵，結(jié)果表明，與空白對照比較，士的寧、馬錢子堿的含量均呈下降趨勢，而士的寧氮氧化物、馬錢子堿氮氧化物有不同程度的增加。

川烏為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的干燥母根，在臨床已有幾千年的應(yīng)用歷史，具祛風(fēng)除濕、溫中止痛之功效。烏頭類藥材中含烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿等雙酯型生物堿。這些雙酯型生物堿既是毒性成分，也是活性成分，但性質(zhì)不穩(wěn)定，遇水加熱容易水解成毒性較小的苯甲酰單酯型生物堿及親水性氨基醇類烏頭原堿。目前，烏頭的炮制方法過分強(qiáng)調(diào)解毒，而忽視烏頭的功效特點(diǎn)。本試驗(yàn)通過雙向固體發(fā)酵技術(shù)對烏頭類中藥進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究，以期達(dá)到去毒存（增）效的目的。此項(xiàng)研究內(nèi)容國內(nèi)、外尚未見報(bào)道。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-10AT型高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，包括LC-10ATAB雙泵、SPD-10A紫外檢測器、ERC-3415自動(dòng)脫氣機(jī)、AT-5300OVEN柱溫箱（日本島津公司）；AE240型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器（江蘇金壇國勝儀器廠）；國華數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；抽濾泵（瑞士Buchi公司）。

1.2 試劑

乙腈為色譜純（美國Tedia公司），水為雙蒸水，其它試劑均為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 對照品

烏頭堿（批號：110720-200410）、新烏頭堿（批號：0799-9403）、次烏頭堿（批號：0798-9403）對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4 樣品

運(yùn)用“雙向發(fā)酵”技術(shù)，通過槐耳、靈芝、紅栓等真菌的生物轉(zhuǎn)化過程，發(fā)酵后從“藥性基質(zhì)”中獲得19個(gè)川烏的“藥性菌質(zhì)”樣品，另有1個(gè)為空白對照（未經(jīng)發(fā)酵）樣品。

1.5 真菌菌株的選擇

根據(jù)以往“雙向固體發(fā)酵”的經(jīng)驗(yàn)，首選槐耳、靈芝等19種經(jīng)過菌株鑒定的藥用真菌（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所保藏）作為在川烏“藥性基質(zhì)”上進(jìn)行生長條件篩選試驗(yàn)的菌株。

1.6“藥性基質(zhì)”的來源

川烏購自南京市藥材公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭A.carmichaeliDebx.的干燥母根。

1.7 川烏“藥性菌質(zhì)”的培養(yǎng)

在一定的生物技術(shù)控制下，使川烏“藥性基質(zhì)”被槐耳、靈芝、紅栓等真菌發(fā)酵。根據(jù)真菌與基質(zhì)組合的發(fā)酵情況，即菌株能否與“藥性基質(zhì)”相適應(yīng)而正常生長為指標(biāo)，在菌絲體生長一段時(shí)間后，取出各真菌發(fā)酵后的“藥性菌質(zhì)”，低溫干燥，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取烏頭堿1.4 mg、新烏頭堿3.1 mg、次烏頭堿3.9 mg，用0.05%的鹽酸甲醇溶液定容至5 mL，放置冰箱貯藏，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取川烏樣品粉末1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞燒瓶中，加入適量氨試液潤濕，再加入20 mL乙醚，靜置24 h，超聲提取30 min，濾過，40℃水浴揮干，滴加鹽酸-甲醇試液，定容至2 mL，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Hanborn Sci&Tech Bentnach-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-40 mmol·L-1乙酸銨（氨水調(diào)pH 9.5），梯度洗脫（0→10 min，A的體積百分?jǐn)?shù)為12%→20%；10→50 min，A為20%→52%；50→80 min，A為52%→60%）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：240 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.4 樣品含量的測定及烏頭堿類化合物指紋圖譜的建立

取不同真菌發(fā)酵的川烏“藥性菌質(zhì)”，按上述色譜條件與方法，測定樣品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的含量變化和川烏指紋圖譜的差異。

2.2 結(jié)果

2.2.1 菌絲體生長情況及烏頭堿類的含量測定結(jié)果 在同一發(fā)酵條件下，槐耳、靈芝等19種真菌對以川烏生品為“藥性基質(zhì)”的發(fā)酵情況有所不同。根據(jù)真菌與基質(zhì)組合雙方的發(fā)酵情況，初步判定代號為A、B、C、D、E、F、H、L、M、N等19種菌株與藥材“藥性基質(zhì)”基本相適應(yīng)，菌絲體能夠正常生長發(fā)育。

川烏菌質(zhì)得率情況：菌絲體生長的好壞與發(fā)酵后“藥性菌質(zhì)”相對得率（%）呈負(fù)相關(guān)，即菌絲體生長較好者，菌質(zhì)相對得率低；生長較差者，菌質(zhì)相對得率高。菌質(zhì)得率（%）＝藥性菌質(zhì)干重（g）/藥性基質(zhì)干重（g）×100%。

川烏菌質(zhì)得率見表1。

2.2.2 川烏的指紋圖譜 利用HPLC的高分離能力，采集雙向發(fā)酵后川烏藥材中復(fù)雜的化學(xué)成分信息，建立其菌質(zhì)的生物堿類成分的指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

從圖1、圖2可以看出，與發(fā)酵空白對照比較，H、V、O①等真菌作用于川烏后，指紋圖譜中顯示出有不同的新產(chǎn)生的或含量變化較大的未知成分；與市售制川烏比較，指紋圖譜中顯示出相同的成分，但含量明顯高于市售制川烏。

3 討論

表1 川烏菌質(zhì)得率Tab 1 The yield of mycoplasma ofA.carmichaeli

圖1 川烏的HPLC指效圖譜A.混合對照品；B.川烏生藥材；C.川烏發(fā)酵空白對照；D.市售制川烏；E.川烏+V發(fā)酵品；F.川烏+H發(fā)酵品；1.新烏頭堿；2.烏頭堿；3.次烏頭堿Fig 1 HPLC chromatograms ofA.carmichaeliA.mixed substance；B.A.carmichaeli；C.fermented A.carmichaeli control；D.A.carmichaeli for sale；E.A.carmichaeli+fermented V；F.A.carmichaeli+fermented H；1.aconitine；2.mesaconine；3.hypaconitine

本試驗(yàn)用川烏藥材作為“藥性基質(zhì)”，由選定的藥用真菌發(fā)酵，產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生理活動(dòng)和生化效應(yīng)，產(chǎn)生新的活性成分和新的功能。一方面藥用真菌在生長過程中會產(chǎn)生各種各樣的生物活性物質(zhì)；另一方面進(jìn)行生命活動(dòng)所產(chǎn)生的豐富而強(qiáng)大的酶系則是中藥發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)代發(fā)酵工程證實(shí)，微生物具有水解、酯化、氧化、乙?；?、甲基化、羥基化和羰基化等多種能力，有可能將烏頭類中藥中的毒性成分雙酯型生物堿分解為單酯型或醇胺型或未知類型生物堿，達(dá)到降低毒性的目的；也可能將烏頭中的成分轉(zhuǎn)化形成新的成分，或者烏頭中的成分與藥用真菌的次生代謝產(chǎn)物發(fā)生復(fù)方、協(xié)同作用，形成新的化合物。

圖2 HPLC圖譜比較A.川烏發(fā)酵空白對照；B.川烏+O①發(fā)酵品Fig 2 Comparison of HPLC chromatogramsA.fermentedA.carmichaeli control；B.A.carmichaeli+femented O①

由上述圖譜的對比可以看出，通過真菌的發(fā)酵分解，烏頭堿類的含量在菌株的轉(zhuǎn)化作用下明顯降低，說明烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿均在真菌的作用下參與了生物轉(zhuǎn)化。而且一些真菌在發(fā)酵后，與市售制川烏比較，指紋圖譜中顯示出相同的成分，但含量明顯高于市售制川烏。其藥效和毒理實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。

藥用真菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化較其他方法有以下優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、能耗少、操作簡單、低毒、低殘留、不造成環(huán)境污染和后處理簡單等。其可能完成化學(xué)方法難以進(jìn)行或不能進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，得到結(jié)構(gòu)更合理或活性更強(qiáng)的先導(dǎo)化合物。因此，本項(xiàng)研究不僅可為烏頭炮制提供新工藝，對其具毒性且有效的成分含量進(jìn)行測定和研究，為科學(xué)地闡明雙向固體發(fā)酵機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也可保證中藥臨床使用的安全和有效。

[1]莊 毅.藥用真菌新型（雙向性）固體發(fā)酵工程[J].中國食用菌，2002，21（4）：3.

[2]潘 揚(yáng)，張 弦，蔣亞平，等.雙向發(fā)酵前后馬錢子生物堿含量及其HPLC指紋譜的比較[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22（6）：362.

Effects of Two-way Fermentation on the Fingerprints ofAconitum carmichaeliand the Content of Aconitine

WANG Shen-yan，PAN Yang，JIANG Ya-ping，TANG Hai-xia，CHEN Jian-wei（Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China）

OBJECTIVE：To observe the contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine and the difference of HPLC fingerprints ofAconitum carmichaeliafter fermented with 19 kinds of medicine fungus.METHODS：Under the control of certain experiment conditions，A.carmichaeliwas used as ground substance and fermented by two-way fermentation with 19 kinds of medicine fungus，such asTrametes robiniophila，Ganoderma lucidum，Pycnoporus cinnabarius.The product of medicinal ground substance mixed with mycelia was called“medicinal mycoplasma”.An RP-HPLC method was then established to determine the contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine.The difference of the content and HPLC fingerprints were compared.RESULTS：At different zymolytic times，most of their mycelia grew normally and quickly，especially number A，C，D，E，F(xiàn)，M，Q，V，SW，いand so on.The contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine in fermentedA.carmichaeliwere significantly lower than inA.carmichaeli.CONCLUSION：The contents of aconitine，mesaconine and hypaconitine in“medicinal mycoplasma”have been decreased significantly.Two-way fermentation is conducive exploration of biotechnology in the filed of traditional Chinese medicine.

Aconitum carmichaeli；Aconitine；Mesaconine；Hypaconitine；Biotransformation；RP-HLPC

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3712-03

2010-01-28

2010-05-05）