王琳，朱纓，范淦彬（.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘇州市 5009；.蘇州派騰生物醫(yī)藥科技有限公司，蘇州市 5009）

HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地葉下珠中槲皮素的含量Δ

王琳1＊，朱纓1，范淦彬2（1.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘇州市 215009；2.蘇州派騰生物醫(yī)藥科技有限公司，蘇州市 215009）

目的：建立以高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定不同產(chǎn)地葉下珠中槲皮素含量的方法。方法：色譜柱為Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸（30∶70），流速為1 mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm。結(jié)果：槲皮素進(jìn)樣量在0.05～0.40 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 9）；平均回收率為102.23%，RSD＝1.87%（n＝6）。云南產(chǎn)的葉下珠中槲皮素的含量最高。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可為正確選擇葉下珠原料及其綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

葉下珠；槲皮素；高效液相色譜法；含量測(cè)定；產(chǎn)地

Δ蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技項(xiàng)目課題（Szwzy200713）

＊助教，執(zhí)業(yè)中藥師，碩士。研究方向：中藥的開發(fā)與應(yīng)用。電話：0512-62690370。E-mail：wanglinlinda@126.com

葉下珠（Phyllanthusurinaria L.）為大戟科葉下珠屬植物葉下珠的干燥全草，又名珍珠草、夜合草、陰陽(yáng)草，全國(guó)有33種4個(gè)變種，主要分布于長(zhǎng)江流域和南方諸省[1]。該藥具有清熱、解毒、明目等功效，是一種傳統(tǒng)的中草藥。本課題組通過(guò)文獻(xiàn)[2，3]和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，葉下珠具有明顯的抗乙型肝炎病毒（HBV）、保護(hù)肝損傷等藥理作用，是一種尚未開發(fā)利用的很有價(jià)值的藥用資源，且其抗HBV有效成分之一就為黃酮。目前，對(duì)不同產(chǎn)地葉下珠中黃酮含量研究較少，筆者以槲皮素作為葉下珠中黃酮類成分的代表，故采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定廣西、云南、江蘇、浙江、廣東等省的葉下珠中槲皮素的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括G1311A四元泵、G1315B DAD檢測(cè)器、G1322在線脫氣機(jī)、7725i手動(dòng)進(jìn)樣器、Aglient化學(xué)工作站（美國(guó)Aglient公司）；CP225D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 試藥

槲皮素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100081-200406）；葉下珠藥材由本課題組成員親自到廣西、云南、江蘇、浙江、廣東等省采集，全部為2008年生產(chǎn)，經(jīng)蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院朱纓副教授鑒定均為大戟科葉下珠屬植物葉下珠P.urinariaL.。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸（30∶70）；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。在上述條件下，葉下珠供試品中槲皮素可達(dá)到基線分離，且供試品中其它組分色譜峰無(wú)干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.槲皮素對(duì)照品；B.葉下珠供試品；a.槲皮素Fig 1 HPLC chromatogramsA.quercetin control；B.test samples；a.quercetin

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定干燥至恒重的槲皮素對(duì)照品5.0 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為0.05 mg·mL-1的槲皮素對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取葉下珠粗粉約15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇147 mL，再精密加入濃鹽酸3 mL，稱重，加熱回流提取2 h，放冷，再稱重，用50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以槲皮素峰面積積分值（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝823.78X+1.974（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，槲皮素進(jìn)樣量在0.05～0.40 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取濃度為0.012 mg·mL-1的槲皮素對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，峰面積平均值為195.2，RSD＝2.14%，表明儀器精密度較好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取廣西產(chǎn)葉下珠藥材粗粉6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，峰面積平均值為106.5，平均含量為0.127 mg·g-1，RSD＝1.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取廣西產(chǎn)葉下珠藥材制備的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h測(cè)定。結(jié)果，峰面積平均值為104.7，RSD＝2.42%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量（0.127 mg·g-1）的廣西產(chǎn)葉下珠藥材粉末6份，每份約7.5 g，精密稱定，分別加入濃度為0.954 mg·mL-1的槲皮素對(duì)照品溶液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

將采于不同產(chǎn)地的葉下珠藥材分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL，按上述方法測(cè)定葉下珠中槲皮素的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

表2 葉下珠中槲皮素含量測(cè)定結(jié)果（n＝5）Tab 2Content determination of quercetin in P.urinaria（n＝5）

本試驗(yàn)曾采用（1）100%甲醇+濃酸、（2）75%甲醇+濃酸、（3）50%甲醇+濃酸回流提取，以及（4）超聲波法提取[4]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，方法（1）和方法（4）中槲皮素提取率低，方法（3）中雜質(zhì)較多、難分離，只有方法（2）中槲皮素提取率高且易于分離。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

曾有人采用254、360[5]、370 nm 3個(gè)波長(zhǎng)測(cè)定槲皮素含量。為了找到最合適的檢測(cè)波長(zhǎng)，筆者采用DAD檢測(cè)器對(duì)槲皮素對(duì)照品溶液進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在波長(zhǎng)370 nm處，槲皮素吸收峰的峰形較好、吸收值較大，故選擇370 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，而吸收值最低的285 nm作為參比波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)中曾選用甲醇-0.4%磷酸[5，6]、甲醇-乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇會(huì)使槲皮素形成前延峰，影響檢測(cè)結(jié)果，故選擇了最后一種流動(dòng)相條件。在流動(dòng)相中加入一定量的磷酸是為了改善峰形和分離度，但為了增加柱的穩(wěn)定性和使用壽命，應(yīng)在保證分離度的情況下將磷酸的用量控制在最低。

綜上，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，不同產(chǎn)地葉下珠中槲皮素的含量以云南產(chǎn)最高，且所建方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可為正確選擇葉下珠原料及其綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

[1]吳克芹，吳克霞，李俊婕.抗乙肝植物藥葉下珠的研究進(jìn)展[J].齊魯藥事，2008，27（10）：612.

[2]魯玉輝，符林春.葉下珠復(fù)方在體外細(xì)胞培養(yǎng)中抗HBV活性的研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2007，7（25）：19.

[3]鄧學(xué)龍，朱宇同，郭興伯，等.先天和后天感染鴨乙肝病毒的廣州麻鴨外周血中病毒血癥的動(dòng)態(tài)比較及應(yīng)用[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，16（1）：561.

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Content Determination of Quercetin inPhyllanthus urinariafrom Different Habitats by HPLC

WANG Lin，ZHU Ying（Suzhou Heath College，Suzhou 215009，China）
FAN Gan-bin（Suzhou Patent Biological and Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Suzhou 215009，China）

OBJECTIVE：To develop a HPLC method for content determine of quercetin inPhyllanthus urinariafrom different habitats.METHODS：The determination was performed on Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）column with acetonitrile-0.2%phosphoric acid（30∶70）as mobile phase at flow rate of 1 mL·min-1.The detection wavelength was set at 370 nm.RESULTS：The linear range of quercetin was 0.05～0.40 μg（r＝0.999 9）with an average recovery of 102.23%（RSD＝1.87%，n＝6）.CONCLUSION：The method is simple，rapid and accurate.It provides scientific basis for the selection of raw material and comprehensive development ofP.urinaria.

Phyllanthus urinaria；Quercetin；HPLC；Content determination；Habitats

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3717-02

2009-10-02

2009-11-24）