劉筱瀟，孫穎穎，管習(xí)超，王長海

(1.淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港222005；2.煙臺大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺264005；3.大連理工大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)院，遼寧 大連116024)

3種海洋微藻多糖提取工藝的研究

劉筱瀟1，孫穎穎1，管習(xí)超1，王長海2,3

(1.淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港222005；2.煙臺大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺264005；3.大連理工大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)院，遼寧 大連116024)

采用熱水浸提法，通過一系列單因素試驗(yàn)，研究了提取時間、pH、溫度和液料比對四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻等 3種海洋微藻多糖提取的影響。在此基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化多糖的提取工藝。最后，采用適宜提取工藝制備 3種海洋微藻粗多糖樣品，并測定樣品蛋白質(zhì)和多糖含量。單因素結(jié)果表明，提取時間、pH、溫度和液料比均能影響四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻多糖的提取。其中，提取時間顯著影響新月菱形藻多糖的提取，提取pH對四爿藻和新月菱形藻多糖的提取有顯著影響，而提取溫度和料液比均能顯著影響 3種海洋微藻多糖的提取。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖提取的適宜提取時間，溫度，pH和料液比分別為80℃、60℃、80℃，240 min、240 min、120 min；10、10、10；1:15、1:25、1:25。制備的粗多糖樣品中蛋白質(zhì)和多糖含量分別為 0.59%、0.76%、1.50%和 51.4%、17.2%、13.5%。很低的蛋白質(zhì)含量和較高的多糖含量，表明采用上述試驗(yàn)確定的提取工藝獲得的粗多糖樣品純度較高，利于樣品的后續(xù)分離純化。

多糖；海洋微藻；熱水浸提；提取工藝

Abstract:Aiming at the extraction of polysaccharide from Tetraselmis elliptica,Nitzschia closterium and Phaeodactylum triconutum with hot-water immersed method,experiment factors and levels were firstly selected by single-factor tests in this paper.4 factors of extraction included extraction time,extraction pH,extraction temperature and ratio of water to material.On this basis,extraction process of polysaccharide was optimized further by orthogonal experiments.Finally,prepared crude polysaccharide samples using the suitable extraction process,and determined of protein and polysaccharide contents of those samples.The results showed that the extraction time,extraction pH,extraction temperature and the ratio of water to material could affect the polysaccharide extraction of the three species of the marine microalgae.And the extraction time had significant effect on the polysaccharide extraction of N.closterium,and the extraction pH could significantly affect the polysaccharide extraction from T.elliptica and N.closterium,and the extraction temperature and the ratio of water to material had strongly effects on the polysaccharide extraction from three species of the marine microalgae.Orthogonal experimental results showed that the appropriate extraction process of polysaccharide from T.elliptica,N.closterium and P.triconutum as follows: extraction temperature,extraction time,extraction pH and liquid feed ratio were 80℃,60℃,80℃; 240min,240min,120min; 10,10,10; 1:15,1:25,1:25,respectively.The protein and polysaccharide content of polysaccharide samples were 0.59%,0.76%,1.50%,and 51.4%,17.2%,13.5%,respectively; very low protein content and higher content of polysaccharide,indicating that adoption of these experiments to determine the extraction process of crude polysaccharides was higher purity sample,the follow-up samples in favor of the separation purification.

Keywords:polysaccharide; marine microalgae; hot-water immersed; extraction process

海洋微藻多糖是海洋微藻的生物活性物質(zhì)之一。近年來，隨著海洋藥物的興起，人們逐漸發(fā)現(xiàn)海洋微藻多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射和降血糖等活性功效，其作為藥物和藥物中間體的研究已成為藥物研究的重點(diǎn)[1]。Hayashi等用熱水從螺旋藻（Spirulina sp.）中提取的新型硫酸多糖（Ca-SP）具有顯著的抗病毒活性[2,3]。Fabregas等發(fā)現(xiàn)鹽藻（Dunaliella salina）的硫酸化多糖在體內(nèi)對敗血癥病毒（VHSV）和非洲豬熱病毒（ASFV）的復(fù)制有抑制作用，尤其在抗腫瘤方面，鹽藻多糖復(fù)合物能明顯抑制實(shí)體瘤 S180的生長，其抑制率高達(dá) 60%以上[4]。顧寧琰等研究了紫球藻（Porphyridium cruentum）胞外多糖在體內(nèi)對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)此多糖能顯著提高小鼠脾細(xì)胞增殖水平、NK細(xì)胞殺傷活性和 IL-2活性[5]。吳潔等指出，極大螺旋藻胞外多糖（EPⅡ）具有提高小鼠NK細(xì)胞殺傷活力[6]。鮑康德等發(fā)現(xiàn)，海洋浮游硅藻胞外多糖具有抗K562腫瘤細(xì)胞、抗VHSV和ASFV病毒以及免疫調(diào)節(jié)作用等多種藥理活性[7,8]。四爿藻（Tetraselmis elliptica）多糖對小鼠體內(nèi)黑色素瘤的抑制作用也被報(bào)道[9]。由于海洋微藻的生長條件和環(huán)境特點(diǎn)決定了其具有一些有別于陸生植物多糖的結(jié)構(gòu)和功能，因此，加快海洋微藻多糖的開發(fā)可以彌補(bǔ)陸地植物多糖及海藻多糖藥用特性的不足。

然而，目前對海洋微藻多糖的研究遠(yuǎn)不及陸地植物和大型藻類多，國內(nèi)此類研究報(bào)道較少，且主要集中在多糖的抗腫瘤、抗病毒、抗輻射和提高免疫力等活性研究方面[2-9]，而較少報(bào)道海洋微藻多糖的提取工藝[10-13]。本文選用水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)常用的3種餌料微藻-四爿藻（Tetraselmis elliptica）、新月菱形藻（Nitzschia closterium）和三角褐指藻（Phaeodactylum triconutum），采用熱水浸提法，通過一系列的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，分析溫度、提取時間、pH和液料比4個因素對3種海洋微藻多糖提取的影響，獲得多糖的最佳提取工藝，以期為深入開展海洋微藻多糖的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻由中國海洋大學(xué)提供，經(jīng)進(jìn)一步分離純化后由煙臺大學(xué)海洋生化工程研究所保存。

1.2 3種微藻藻粉的制備

3種微藻分別置于40 L光照平板生物反應(yīng)器中通氣培養(yǎng)，通氣量2.0 L/min，溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度 3000lx，f/2培養(yǎng)基[14]。培養(yǎng) 10d后，離心，收集藻細(xì)胞，采用冷凍干燥法制備成藻粉。

1.3 3種微藻多糖提取的單因素試驗(yàn)

0.2 g藻粉，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見1.3.1-1.3.4）提取多糖。提取后，離心，上清液經(jīng)3倍體積乙醇沉淀和3% TCA除蛋白后，沉淀，洗滌，獲得粗多糖。

1.3.1 溫度對3種微藻多糖提取的影響 溫度分別設(shè)定為 50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃，pH10，料液比（g/mL）1∶25，提取時間240 min。

1.3.2 提取時間對3種微藻多糖提取的影響pH10，料液比1∶25，溫度80 ℃，提取時間分別設(shè)定為 60 min、120 min、180 min、240 min、300 min和360 min。

1.3.3 pH對3種微藻多糖提取的影響 pH依次為 6、7、8、9、10和11，料液比1∶5，溫度80℃，提取時間240min。

1.3.4 料液比對3種微藻多糖提取的影響 設(shè)定pH10，溫度80 ℃，提取時間240 min，料液比依次為 1∶10、1∶5、1∶20、1∶25、1∶30 和 1∶35。

1.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按照4因素3水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，進(jìn)一步分析提取時間、pH、溫度和料液比對多糖提取的影響，因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factor levels of orthogonal experiment

1.5 蛋白質(zhì)和多糖的測定

采用正交試驗(yàn)獲得的適宜提取工藝制備3種海洋微藻粗多糖。用適量蒸餾水溶解樣品后，分別采用考馬斯亮藍(lán)法和蒽酮比色法[15]測定可溶性蛋白質(zhì)和多糖的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS11.5軟件包進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以 P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

粗多糖提取率為粗多糖質(zhì)量與藻粉或胞外物質(zhì)量的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度對 3種海洋微藻粗多糖提取的影響由圖1可知，溫度對四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻的粗多糖提取率的影響類似。在一定溫度范圍內(nèi)，3種海洋微藻粗多糖提取率隨溫度的升高而顯著（P ＜0.05）增大，均在80℃溫度時達(dá)到最大值，此時，四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻的粗多糖提取率分別為 50℃時粗多糖提取率的 1.9倍、2.0倍和1.5倍。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，3種海洋微藻粗多糖提取率均出現(xiàn)下降的趨勢，但仍然高于低溫條件下的粗多糖提取率。此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溫度越高，制備的粗多糖樣品色澤越深，我們認(rèn)為這可能是在堿性條件下高溫易導(dǎo)致多糖降解，從而致使粗多糖樣品顏色較深[8,10]。

2.1.2 提取時間對3種海洋微藻粗多糖提取的影響從圖2可以看出，提取時間在60～180 min范圍內(nèi)，四爿藻粗多糖提取率隨提取時間的增加而增大，在180 min時粗多糖提取率達(dá)到最大值，為60 min時粗多糖提取率的1.34倍。隨后，當(dāng)提取時間繼續(xù)增大時，粗多糖提取率開始下降；并且提取時間超過300 min時，粗多糖提取率甚至低于60 min時的粗多糖提取率。對新月菱形藻而言，提取時間在60～300 min范圍內(nèi)，粗多糖提取率隨提取時間的增加而顯著（P ＜0.05）增大，300 min時粗多糖提取率為60 min時粗多糖提取率的2.17倍。當(dāng)提取時間繼續(xù)增大時，新月菱形藻粗多糖提取率稍有下降，其數(shù)值為60min時粗多糖提取率的1.84倍。提取時間對三角褐指藻粗多糖提取的影響類似于其對四爿藻粗多糖提取的影響；在120 min時，三角褐指藻粗多糖提取率達(dá)到最大值，為60 min時粗多糖提取率的1.34倍。

圖1 溫度對3種海洋微藻粗多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the polysaccharide extraction rate of three species of marine microalgae

圖2 提取時間對3種海洋微藻粗多糖提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time on the polysaccharide extraction rate of three species of marine microalgae

上述結(jié)果表明，提取時間能夠影響3種海洋微藻粗多糖的提取，尤其能顯著影響新月菱形藻粗多糖的提取。四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖的適宜提取時間分別為 180 min、300 min和120 min。在熱水浸提法中，適當(dāng)延長提取時間利于微藻胞內(nèi)多糖的充分溶出，從而在一定時間范圍內(nèi)微藻的粗多糖提取率隨提取時間的增加而增大。然而，提取時間過長，則會引起多糖的降解，致使粗多糖提取率下降[12,13]（圖2）。在本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，綜合考慮簡化實(shí)驗(yàn)操作和降低能耗，將3種海洋微藻粗多糖的提取時間設(shè)定為240 min。

2.1.3 pH對3種海洋微藻粗多糖提取的影響 圖3表明，堿性 pH更利于四爿藻多糖的提取。當(dāng) pH在6-10的范圍內(nèi)，四爿藻粗多糖提取率隨pH的增大而顯著（P ＜0.05）增加，并于pH10時達(dá)到最大值，其數(shù)值為pH6提取率的2.73倍。當(dāng)pH繼續(xù)增大時，粗多糖提取率開始下降，但仍高于pH6時的粗多糖提取率。pH從6升高至9的過程中，隨著pH的增大新月菱形藻和三角褐指藻的粗多糖提取率也隨之增加，在pH9時達(dá)到最大值。當(dāng)pH繼續(xù)增大時，新月菱形藻粗多糖提取率出現(xiàn)明顯的（P＜0.05）下降，pH11時粗多糖提取率比pH6時的粗多糖提取率降低了61.5%；而三角褐指藻的粗多糖提取率并未發(fā)生明顯降低現(xiàn)象，其數(shù)值仍然高于pH6時的粗多糖提取率。

圖3 pH對3種海洋微藻粗多糖提取率的影響Fig.3 Effects of extraction pH on the polysaccharide extraction rate of three species of marine microalgae

比較發(fā)現(xiàn)pH對四爿藻和新月菱形藻的粗多糖提取有顯著（P ＜0.05）的影響。并且偏堿性pH下3種海洋微藻的粗多糖提取率高于酸性pH時的粗多糖提取率，分析其原因：這可能是因?yàn)槲⒃宥嗵侵杏幸徊糠炙嵝远嗵?，它們隨提取液堿性的增強(qiáng)而更易被溶出。另外，多糖與蛋白質(zhì)等物質(zhì)之間可能會以非共價(jià)鍵形態(tài)結(jié)合在一起，在偏堿性條件下，蛋白質(zhì)等易被溶解，從而將多糖釋放出來

[12,13,16]。然而，pH也不能過高，這是因?yàn)樵跓釅A環(huán)境下有一部分多糖可能被降解，從而導(dǎo)致粗多糖提取率的下降（pH11時新月菱形藻的粗多糖提取率非常低）。綜上所述，四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖的適宜pH分別為10、9和9。為了統(tǒng)一后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)操作，故將3種海洋微藻粗多糖的pH定為10。

2.1.4 料液比對 3種海洋微藻粗多糖提取的影響料液比顯著地（P ＜0.05）影響了四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖的提取。料液比從1:10增大到1:25過程中，四爿藻粗多糖提取率隨液體用量增加而顯著（P ＜0.05）增大，當(dāng)料液比為 1:25時，粗多糖提取率最大，其數(shù)值為1:10料液比下粗多糖提取率的3.0倍；當(dāng)提取液用量繼續(xù)增加時，粗多糖提取率開始下降，但下降趨勢并不顯著（P ＞0.05）。對新月菱形藻而言，料液比為1:15、1:20和1:25時，粗多糖提取率均較大，其值分別為1:10料液比的粗多糖提取率的2.4倍、1.8倍和1.6倍；當(dāng)提取液用量繼續(xù)增加時，粗多糖提取率有所下降，但仍然高于1:10料液比時的粗多糖提取率。料液比對三角褐指藻粗多糖提取率的影響類似于其對四爿藻粗多糖提取率的影響，即當(dāng)料液比從1:10增大到1:25過程中，三角褐指藻粗多糖提取率隨提取液用量的增加而增大，并于1:25料液比時達(dá)到最大值；當(dāng)提取液用量繼續(xù)增加時，粗多糖提取率稍有下降。

圖4 料液比對3種海洋微藻粗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of water to material on the polysaccharide extraction rate of three species of marine microalgae

上述結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)中1:25（或1:15）料液比所提供的提取液用量足夠四爿藻和三角褐指藻（或新月菱形藻）多糖的溶出。提取液用量過低，不利于多糖的溶出，并且無法有效降低蛋白質(zhì)的濃度，致使脫蛋白過程中，蛋白質(zhì)沉淀吸附多糖，造成多糖損失[4]；而過高的提取液用量，對多糖的溶出無明顯增加的效果[7]，并且由于增加了下游濃縮工藝的負(fù)擔(dān)，會致使粗多糖提取率有所下降。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用 L9(34)正交設(shè)計(jì)進(jìn)一步分析溫度、pH、提取時間和液料比對3種海洋微藻多糖提取的影響，結(jié)果分析見表 2。通過表 2的直觀分析可知，四爿藻粗多糖提取的最佳條件為提取溫度80℃、提取時間240 min、pH10和料液比1:15，在正交表中未見此試驗(yàn)組合（2321組合）。采用追加實(shí)驗(yàn)，將其與正交表中第6組實(shí)驗(yàn)做比較。追加實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2321組合獲得的粗多糖提取率高于第6組實(shí)驗(yàn)。鑒于此，四爿藻粗多糖的適宜溫度、提取時間、pH和料液比分別為80℃、240 min、10和1:15。新月菱形藻適宜的溫度、提取時間、pH和料液比分別為60℃、240 min、10和1:25，但正交表中同樣未見此試驗(yàn)組合（1322組合），因此，采用追加實(shí)驗(yàn)與正交表中的第2組實(shí)驗(yàn)做比較。結(jié)果表明，1322試驗(yàn)組合獲得的粗多糖提取率高于第2組實(shí)驗(yàn)。因此，新月菱形藻粗多糖適宜提取條件為溫度60℃、提取時間240 min、pH10和料液比1:25。對于三角褐指藻而言，粗多糖適宜的溫度、提取時間、pH和料液比分別為80℃、120 min、10和1:25，為正交表中第4組實(shí)驗(yàn)。

同時，比較極差發(fā)現(xiàn)，溫度、提取時間、pH和料液比對3種海洋微藻粗多糖提取率的影響順序不同：pH＞提取時間＞料液比＞溫度（四爿藻）；pH＞溫度＞提取時間＞料液比（新月菱形藻）；溫度＞提取時間＞pH＞料液比（三角褐指藻）。這就表明，不同種屬海洋微藻多糖提取存在差異[17,18]。

2.3 樣品蛋白質(zhì)和多糖含量的測定

四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖樣品中蛋白質(zhì)和多糖的含量分別為0.59%、0.76%、1.50%和51.4%、17.2%、13.5%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test of microelement and direct analysis

3 結(jié) 論

利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)獲得3種微藻粗多糖的適宜提取時間，溫度，pH和料液比分別為240 min、240 min、120 min；80 ℃、60 ℃、80 ℃；10、10 和 10；1∶15、1∶25、1∶25。隨后，采用適宜提取工藝制備的3種微藻粗多糖樣品中蛋白質(zhì)含量很低，而多糖含量較高，表明采用上述試驗(yàn)確定的提取工藝獲得的粗多糖樣品純度較高，利于樣品的后續(xù)分離純化。

[1]王安利,胡俊榮.海藻多糖生物活性研究新進(jìn)展 [J].海洋科學(xué),2002,26(9): 36-39.

[2]Haysahi K,Haysahi T,Kojima I.A natural sulfated polysaccharide,calium spirulan,isolation from Spirulina platensis: in vitro and in vivo evaluation of anti-herps simp lex virus and anti-humanimmunodeficiency virus activities [J].AIDS Res Hum Retr,1996,12(15): 1463-1471.

[3]Haysahi T,Haysahi K.Calcium Spirulina,an inhibitor of enveloped virus replication,from a blue-green alga Spirulina [J].Natural Product,1996,59(1): 83-87.

[4]Fabregas J,Garcia D,Fernandez-Alonso M.In vitro inhibition of the replication of haemorrhagic septicaemia virus (VHSV)and African swine fever virus (ASFV)by extracts rom marine microalgae [J].Antiviral Res,1999,44 (1): 67-73.

[5]顧寧琰,劉宇峰.紫球藻胞外多糖抗輻射的生物學(xué)活性研究 [J].海洋科學(xué),2002,26(12): 53-56.

[6]吳潔,張成武,劉義峰,等.極大螺旋藻胞外多糖 EPⅡ的分離、純化及免疫學(xué)研究 [J].藥物生物技術(shù),1999,6(2): 99-102.

[7]鮑康德,張小平,鄭維發(fā).海洋浮游硅藻胞外多糖研究進(jìn)展 [J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版,2005,28(2): 214-217.

[8]鄭維發(fā),陳才法,鮑康德,等.新月菱形藻胞外多糖的成分及其硫酸酯的制備 [J].中草藥,2005,36(12): 1790-1793.

[9]劉艷,楊海波,趙蓮華,等.四爿藻多糖的分離分析及其生物活性的初步研究 [J].生物技術(shù),2007,17(2): 53-56.

[10]王長海,溫少紅,鞠寶.紫球藻多糖的提取和測定 [J].中國海洋藥物,1999,18(1): 22-25.

[11]張新宇,王雷,李光友,等.綠色巴夫藻硒多糖的提取、分離與純化 [J].海洋與湖沼,2000,31(6): 643-646.

[12]徐錫蓮,童微星,雷引林,等.鹽藻胞外多糖分離純化方法研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,26(4): 28-33.

[13]戴軍,尹鴻萍,湯堅(jiān).杜氏鹽藻多糖提取工藝的優(yōu)化 [J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007,3(3): 123-127.

[14]Guillard R R L,Ryther J H.Studies of marine planktonic diatom.I.Cyclotella nana H.and Detonula confervacea (Cleve)Gran [J].Can J M,1962,17(8): 309-314.

[15]浦寅芳,孫穎穎,嚴(yán)軍威.不同環(huán)境因子對球等鞭金藻胞內(nèi)和胞外多糖合成的影響 [J].淮海工學(xué)院學(xué)報(bào),2008,17(4): 61-64.

[16]張新宇,王雷,李光友,等.綠色巴夫藻硒多糖的提取、分離與純化 [J].海洋與湖沼,2000,31(6): 643-646.

[17]陳峰,姜悅.微藻生物技術(shù) [M].北京: 中國輕工業(yè)出版社,1999: 240-272.

[18]李亞清,楊海波,劉艷,等.小球藻多糖的分離純化和組成分析[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,21(3): 294-296.

Study on the extraction process of polysaccharide from three species of marine microalgae

LIU Xiao-xiao1,SUN Ying-ying1,GUAN Xi-chao1,WANG Chang-hai2,3

(1.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China;2.School of Ocean,Yantai University,Yantai 264005,China;3.School of Environmental and Biological Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

Q946.3

A

1001-6932(2010)05-0534-06

2009-12-06；

2009-12-25

連云港市科技發(fā)展計(jì)劃（工業(yè)攻關(guān)）項(xiàng)目（CG0803-1）；“十一五”科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目（2006BAD09A01）

劉筱瀟（1988－），女，本科生，主要從事海洋生化工程研究。電子郵箱：syy-999@163.com

孫穎穎，電子郵箱：syy-999@163.com