李燕杰，朱小花，夏雨，袁根良，楊公明

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

不同培養(yǎng)條件對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的影響研究

李燕杰，朱小花，夏雨，袁根良，楊公明*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

研究生物被膜態(tài)微生物的特性，以常見的食源性病原菌單核細(xì)胞增生性李斯特菌為研究對(duì)象，分別采用微孔平板和結(jié)晶紫染色法培養(yǎng)、觀察、檢測不同培養(yǎng)條件下被膜的形成與生長。試驗(yàn)結(jié)果表明：在35℃，中性略偏堿性條件下，TSB培養(yǎng)6 h～8 h，單增李斯特菌可形成穩(wěn)定的生物被膜，添加適量的氯化鈉和葡萄糖可提高單增李斯特菌形成被膜的能力，揭示富營養(yǎng)環(huán)境有利于單增李斯特菌形成被膜。

單核細(xì)胞增生性李斯特菌；生物被膜；形成；培養(yǎng)條件

Abstract:Listeria monocytogenes,as one of the most common foodborne pathogenic bacterium,which was used in this study to research the characters of microorganisms in biofilm status.Microtiter-plate method and crystal violet staining were used to stimulate biofilm formation and determination the biomass.The results showed that L.monocytogenes formed stable biofilms at 35℃under neutral and alkalescence condition,culturing for 6 to 8 hours in TSB.The ability of Listeria monocytogenes formed biofilms would be improved by adding proper sodium chloride and glucose in culture medium.The results suggest that eutrophic condition is beneficial to the forming of Listeria monocytogenes biofilm.

Key words：Listeria monocytogenes;biofilm;formation;culture condition

自20世紀(jì)70年代末加拿大微生物學(xué)家J.William Costerton首次正式提出生物被膜（biofilm,簡稱BF）的相關(guān)理論以來[1-2]，越來越多的研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)自然界中各種微生物并非以單個(gè)的浮游狀態(tài)存在，更多的是以群體的被膜形式生存[3-4]。所謂生物被膜是由附著于惰性或活性實(shí)體表面的微生物細(xì)胞和包裹微生物的水合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性微生物群落，是微生物黏附表面生活時(shí)所采取的一種特殊生存狀態(tài)[5-6]。生物被膜與常見的浮游狀態(tài)微生物有著本質(zhì)的不同，其抗性更強(qiáng)、危害更加嚴(yán)重，且更難清除[7-8]。

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，簡稱LM、單增李斯特菌）是一種對(duì)人畜危害極為嚴(yán)重的人畜共患病病原菌，也是目前國際公認(rèn)的重要食源性病原菌之一[9-10]。食品加工原輔料富含營養(yǎng)物質(zhì)，可為單增李斯特菌生物被膜的形成及生長創(chuàng)造有利條件。例如Charlton、Gulten等報(bào)道從156家乳品加工廠中取得的597份樣品經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)有超過12.6%的樣品檢出含有李斯特菌，其中50.7%為單增李斯特菌[11-12]。一旦食品加工環(huán)境不慎感染單增李斯特菌并形成生物被膜后，就會(huì)顯著增強(qiáng)其對(duì)消毒劑及光、熱、紫外線等的耐受性，這就使得常規(guī)的殺菌方法不能有效滅菌。同時(shí)，單增李斯特菌形成的生物被膜還有可能是其它致病菌及腐敗微生物的藏身之所，從而增加了導(dǎo)致食品加工環(huán)境以及食品本身污染或發(fā)生二次污染的風(fēng)險(xiǎn)，甚至?xí)鹗澄镏卸臼录13-15]。因此研究和防范單增李斯特菌生物被膜的形成具有及其重要的意義。

由于生物被膜的形成受菌種、菌量、時(shí)間、營養(yǎng)條件、生長環(huán)境及載體表面等諸多因素的影響[16-19]，了解這些因素對(duì)生物被膜形成的影響可為研究生物被膜的特性及控制被膜的形成提供參考。本文采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板模擬并檢測單增李斯特菌生物被膜的形成與生長過程，通過光密度值反映被膜的菌量，從而可以揭示不同培養(yǎng)條件對(duì)單增李斯特菌生物被膜生長的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 菌種、主要儀器與試劑

1.1.1 菌種

單核細(xì)胞增生李斯特菌（GIM1.229）：購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；顯微鏡LRH-250-Ⅱ：Nikon Coolscope，JAPAN；生化培養(yǎng)箱：廣東醫(yī)療器械廠；熒光檢測儀FS1000：美國PerkinElmer公司；FEI-XL30環(huán)境掃描電子顯微鏡：荷蘭菲利普電子光學(xué)有限公司；SCD 500離子濺射儀：瑞士Bal-Tec公司；CPD 030臨界點(diǎn)干燥儀：瑞士Bal-Tec公司。

1.1.3 主要試劑和材料

TSB培養(yǎng)基，甲醇，結(jié)晶紫，氯化鈉，葡萄糖，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌生物被膜的制備

將單增李斯特菌菌液接種在無菌TSB培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)過夜，活菌數(shù)達(dá)到約108cfu/mL備用。接入一定量菌液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)一定時(shí)間后備用。

1.2.2 生物被膜光密度值的測定

培養(yǎng)結(jié)束后，棄去96孔板中的培養(yǎng)基，250 μL生理鹽水（已滅菌）沖洗3次，30℃自然風(fēng)干后每個(gè)孔中加入25 μL結(jié)晶紫（1%結(jié)晶紫水溶液），靜置染色20 min，棄去染色液，自來水沖洗直至無色、晾干；此時(shí)，每個(gè)孔的兩邊都可以看到紫色的環(huán)形成即可判斷形成了BF，在染色的板中加入250 μL、95%的乙醇脫色，用空白孔以250 μL培養(yǎng)基作為空白調(diào)零，測A595nm處吸光值[20-21]。

1.2.3 李斯特菌生物被膜的染色觀察

將培養(yǎng)一定時(shí)間的單增李斯特菌被膜，棄去培養(yǎng)基，用無菌水漂洗3次后晾干，1%結(jié)晶紫染色20 min，無菌水沖洗、晾干后顯微鏡觀察。

1.2.4 掃描電鏡觀察李斯特菌生物被膜生長的影響

取出培養(yǎng)一定時(shí)間的生物被膜，將載體經(jīng)無菌操作切割為可供掃描電鏡觀測大小后，滅菌PBS溶液多次充分漂洗，去掉浮游菌，經(jīng)2.5%戊二醛PBS溶液固定過夜后，用PBS溶液沖洗數(shù)遍，再經(jīng)1%的鋨酸固定1 h，50%、70%、80%、90%系列濃度乙醇脫水各10 min，100%乙醇脫水2次，每次15 min，再經(jīng)醋酸異戊醋置換2次，每次15 min，臨界點(diǎn)干燥儀干燥，再噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入TSB溶液230 μL，再接入20 μL李斯特菌液，將培養(yǎng)板分別置于35℃培養(yǎng)一定時(shí)間后進(jìn)行試驗(yàn)測定（方法同1.2.2）。

1.2.6 不同溫度下培養(yǎng)基濃度變化對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入不同濃度的TSB溶液（5%、20%、100%）230 μL，并接入李斯特菌菌液20 μL（108cfu/mL），將培養(yǎng)板分別置于 5、15、25、35、45℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行光密度測量，平行試驗(yàn)3次，取其平均值；以無菌水作為對(duì)照進(jìn)行光密度測量。

1.2.7 不同pH值對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入pH分別為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9 的 TSB 溶液 230 μL，再接入 20 μL李斯特菌菌液，進(jìn)行培養(yǎng)和試驗(yàn)（方法同1.2.2），平行試驗(yàn)3次。

1.2.8 NaCl濃度對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入含不同濃度的氯化鈉（0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）的 TSB培養(yǎng)基230 μL進(jìn)行培養(yǎng)和試驗(yàn)（方法同1.2.2），平行試驗(yàn)3次。

1.2.9 葡萄糖濃度對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響

在細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入含不同濃度的葡萄糖（0%、2%、4%、6%、8%、10%）的TSB培養(yǎng)基230 μL進(jìn)行培養(yǎng)和試驗(yàn)（方法同1.2.2），平行試驗(yàn)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單增李斯特菌生物被膜形成過程

圖1為采用結(jié)晶紫染色、普通顯微鏡觀察到的李斯特菌生物被膜，其中a為培養(yǎng)4 h后的李斯特菌生物被膜，從圖1中可見僅少量菌體附著于載體表面，菌體間呈散落的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；b為同一菌株培養(yǎng)6 h后觀察到的顯微鏡照片，其中附著菌體數(shù)目逐漸增多，且菌體間呈連續(xù)的紫色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；c為培養(yǎng)8 h后觀察到的照片，視野中附著菌體數(shù)目明顯增加，且菌體相連呈現(xiàn)出更為清晰的紫色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；d為培養(yǎng)12 h后觀察到的照片，視野中菌體數(shù)目大量增加，并黏結(jié)聚集呈紫色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且局部菌體大量密集呈團(tuán)狀。

圖2為同種方法培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后采用電子掃描顯微鏡觀察到的李斯特菌生物被膜，如圖2所示，培養(yǎng)4 h后，少量菌體可附著于載體表面；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，載體表面附著的菌體數(shù)目逐漸增多，并分泌大量胞外物質(zhì)將菌體包裹于其中。

不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)單增李斯特菌生物被膜OD值的影響如圖3所示。

由圖1、圖2照片和圖3數(shù)據(jù)可知，0 h~6 h為被膜菌的附著期，是被膜的初始形成期；6 h~8 h后黏附細(xì)菌逐漸增多，可形成初具規(guī)模的生物被膜，8 h后單增李斯特菌生物被膜基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，可認(rèn)為8 h后為李斯特菌生物被膜的成熟穩(wěn)定期。

2.2 不同溫度和培養(yǎng)基濃度對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響

在不同培養(yǎng)溫度下TSB濃度變化對(duì)單增李斯特菌生物被膜OD值的影響見圖4。

如圖 4所示，在 5、15、25、35、45 ℃等不同溫度下分別培養(yǎng)24 h后，李斯特菌生物被膜的OD值隨溫度和TSB濃度的升高而增加，但超過35℃后隨之下降。說明35℃左右是有利于李斯特菌生物被膜的生長溫度，富營養(yǎng)環(huán)境有利于李斯特菌生物被膜的生長。

2.3 不同pH值對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響

不同pH值對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響見圖5。由圖5可見中性略偏堿性條件有利于單增李斯特菌生物被膜的形成，酸性和堿性條件下單增李斯特菌生物被膜的形成均會(huì)受到抑制。

2.4 NaCl濃度對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響

不同NaCl濃度對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響見圖6。

如圖6所示，李斯特菌生物被膜的OD值隨NaCl濃度升高先增加后下降，說明低濃度的NaCl（低于0.5%）可促進(jìn)單增李斯特菌生物被膜的形成，NaCl濃度升高則會(huì)抑制單增李斯特菌生物被膜的形成。

2.5 葡萄糖濃度對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響

葡萄糖濃度變化對(duì)李斯特菌生物被膜生長的影響見圖7。

如圖7所示，李斯特菌生物被膜的OD值隨葡萄糖濃度增加而升高，但當(dāng)其濃度大于6%以后對(duì)單增李斯特菌生物被膜形成的影響效果不甚明顯。說明添加適量葡萄糖有利于單增李斯特菌生物被膜的形成。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)：①李斯特菌生物被膜在試驗(yàn)條件下，6 h~8 h即形成較為穩(wěn)定的BF；②培養(yǎng)時(shí)間、營養(yǎng)條件、培養(yǎng)溫度、pH值、NaCl濃度、葡萄糖濃度等多種因素變化均會(huì)影響李斯特菌生物被膜的形成，富營養(yǎng)環(huán)境、中性及微堿性條件、接近最適生長溫度的培養(yǎng)溫度均可促進(jìn)單增李斯特菌生物被膜的形成，此外，低濃度的NaCl和葡萄糖也有利于單增李斯特菌形成生物被膜。③由于單增李斯特菌在4℃左右還可以繼續(xù)緩慢生長，因此其在低溫下也可以形成生物被膜，單增李斯特菌的這種耐冷性質(zhì)使得它對(duì)于冷藏溫度下存放的即食食品存在極大的危險(xiǎn)，因?yàn)榧词谷揪鷶?shù)量很小也可以在儲(chǔ)存期間大量繁殖。因此為保證食品企業(yè)加工產(chǎn)品的安全，首先應(yīng)嚴(yán)格控制食品加工過程中的微生物，特別是病原菌；其次，應(yīng)縮短加工設(shè)備、器具、生產(chǎn)車間的清洗時(shí)間，避免微生物在其上附著并形成生物被膜；并制定在BF形成前清洗的工藝；最后，低溫加工車間及冷庫中也不能放松微生物控制，需防止及有效抑制嗜冷菌在低溫條件下的生長繁殖。

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The Influence of Various Culture Conditions on Listeria Monocytogenes Biofilm Formation

LI Yan-jie,ZHU Xiao-hua,XIA Yu,YUAN Gen-liang,YANG Gong-ming*
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

2010-06-11

李燕杰（1983—），女（漢），博士研究生，研究方向：食品加工與安全。

*通信作者：楊公明（1950—），男（漢），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品/農(nóng)產(chǎn)品加工。