李悅，侯濱濱，靜寶元

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402）

葡萄柚精油抑菌活性的研究

李悅，侯濱濱，靜寶元

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津300402）

采用紙片擴(kuò)散法、連續(xù)稀釋法和自然沉降法對葡萄柚精油抗菌活性進(jìn)行了測定。葡萄柚精油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、酵母菌的抗菌圈直徑分別為（17.2±1.9）、（9.2±0.7）、（27.1±2.3）、（17.2±2.3）、（18.5±1.6）mm；最低抑菌濃度（MIC）分別為 2.00%、10.00%、1.00%、5.00%和 1.00%；對室內(nèi)空氣中菌類的平均抑菌率達(dá)44.6%。葡萄柚精油有較強(qiáng)的抑菌活性，是一種很有價(jià)值和開發(fā)前景的芳香油植物資源。

葡萄柚；精油；抑菌活性

Abstract:To determining the antibacterial activity of the grapefruit essential oil，we used disk diffusion method,serial dilution method and natural sedimentation method.It was found that the diameters of inhibition zone of Escherichia Coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,Aspergillus Nige,Yeast respectively were （17.2±1.9），（9.2±0.7），（27.1±2.3），（17.2±2.3），（18.5±1.6）mm；And the lowest inhibitory concentration（MIC）respectively were：2.00%，10.00%，1.00%，5.00%and 1.00%.Fungi in indoor air,the average inhibitory rate was 44.6%.The result shows that grapefruit essential oil which has quite strong antibacterial activity enjoys a prosperous marketing prospect.

Key words：grapefruit；essential oil；antibacterial activity

葡萄柚，又名西柚，屬蕓香科，學(xué)名為Citrus paradis，英文名為Grapefruit，Pomelo。其風(fēng)味與甜橙、橘子、檸檬等有很大的差異，從葡萄柚果皮中由水蒸汽蒸餾法取得的揮發(fā)性成分，被稱作葡萄柚精油。外用深層凈化暗瘡及充血的肌膚，緊實(shí)皮膚與組織，治療耳聾，強(qiáng)化肝功能，增進(jìn)食欲，利尿，美白，抗蜂窩組織炎，減肥，增進(jìn)記憶力，凈化思緒，減輕憂郁不安，抗菌。內(nèi)服可以抗菌（抗病毒）、排毒、解毒、利肝、滋補(bǔ)、利尿、利膽、促消化，改善厭食或藥癮，因此葡萄柚精油已被廣泛用于食品及化妝品工業(yè)中。國外食用葡萄柚已有多年歷史，但是由于該水果價(jià)格較高，國內(nèi)食用并不普遍，對其精油的研究就更鮮有研究。為此，筆者測試了葡萄柚精油對條件致病菌大腸桿菌（Escherichia coli）、病源金黃色葡萄球菌（Staphylicoccus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的抑菌活性，以及對室內(nèi)空氣微生物的抑菌生物活性，探討葡萄柚精油在抑菌、抗菌以及食品防腐領(lǐng)域的應(yīng)用前景，旨在為葡萄柚精油的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 新鮮葡萄柚果皮

葡萄柚采購于市場，去掉果肉，果皮留用。

1.1.2 試驗(yàn)菌種

試驗(yàn)所用的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、放線菌、黑曲霉和酵母菌皆由天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 固體培養(yǎng)基

1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌）：牛肉膏3 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，蒸餾水 500 mL，瓊脂 15 g～20 g，調(diào)節(jié)pH值至7.4~7.6，然后121℃蒸汽滅菌30 min。

2）馬鈴薯培養(yǎng)基（培養(yǎng)真菌）：取去皮馬鈴薯20 g，切成小塊，在鍋中加水500 mL煮沸30 min，用雙層紗布過濾，取其濾液，加入蔗糖（或葡萄糖）2 g，加瓊脂2 g，用蒸餾水定容到500 mL，pH值自然，121℃蒸汽滅菌30 min。

3）高氏一號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌）：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 15 g~20 g，蒸餾水1000 mL，pH值7.4~7.6，121℃蒸汽滅菌30 min。

1.1.4 液體培養(yǎng)基

在上述制備方法中，不加入瓊脂就制成相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。

1.2 主要儀器

BC-500臺式離心機(jī)：上海中科生物醫(yī)學(xué)高科技開發(fā)有限公司；PYX-DHS-50×65-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、MJ-180B型霉菌培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HYG-II回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；SW-CJ-1D型無菌操作臺：蘇州凈化設(shè)備廠；LS-B 50L型殺菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器制造廠；PL-2002電子天平：Mettler-Toledo公司。

1.3 研究方法

1.3.1 精油的提取與區(qū)分

將新鮮無霉變的葡萄柚皮浸在濃度為7%~8%的石灰水中（pH值12以上），浸泡16 h~24 h，期間翻動2次~3次，以浸泡果皮呈黃色，脆而不斷為宜。將浸過石灰水的葡萄柚皮用流動清水漂洗干凈，撈起瀝干。先將葡萄柚皮破碎至3 mm大小，用水壓機(jī)進(jìn)行壓榨，形成油水混合物。通常加明礬水使之沉淀，用布袋過濾，除去糊狀殘?jiān)?。然后，采?000 r/min~8000 r/min高速離心機(jī)，分離完畢后，停止加料，讓離心機(jī)轉(zhuǎn)2 min~3 min，沖入大量的清水，把殘存油沖出。靜置與抽濾。分離出的香精油往往帶有少量水分和雜質(zhì)，應(yīng)放在5℃～10℃的冷庫中靜置5 d～7 d，讓雜質(zhì)與水下沉，然后用角虹吸管吸出上層澄清油，通過濾紙或石棉紙濾層的漏斗減壓抽濾，所得葡萄柚精油為無色油狀液體。

1.3.2 微生物生長曲線的測定

濁度法測定[1]大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌的生長曲線：將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在37℃、酵母菌在28℃分別培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h，利用 T6 新世紀(jì)紫外可見光分光光度計(jì)在波長760 nm處測定大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的OD值，在600 nm處測定酵母菌OD值，繪制供試菌種的生長曲線。黑曲霉生長曲線的測定采用稱重法[1]。將供試菌種 28 ℃分別培養(yǎng) 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h后，收集菌體，烘干至恒重，采用精度為0.001 g電子天平稱量菌體重量，繪制生長曲線。

1.3.3 菌懸液的配備

根據(jù)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌生長曲線，當(dāng)其OD值達(dá)0.8時(shí)，抽取菌液0.5 mL加入無菌水倍比稀釋到105cfu/mL~106cfu/mL；抽取OD值為1.2時(shí)的酵母菌液，加入無菌水稀釋到105cfu/mL用于抑菌活性測定。

黑曲霉菌懸液制備：用10 mL無菌水將長有成熟孢子的斜面上的孢子洗脫到三角瓶，加入100 mL液體培養(yǎng)基和玻璃珠，在搖床（200 r/min）上培養(yǎng)18 h后，用經(jīng)滅菌的脫脂棉過濾2次，將濾液放在振蕩器上混勻，加入無菌水對倍稀釋，鏡檢制成107cfu/mL~108cfu/mL單孢懸液，用于抑菌活性測定。

1.3.4 抑菌圈直徑

采用紙片擴(kuò)散法[2]。用打孔器將濾紙制成直徑為6 mm的小圓紙片，干熱滅菌后，備用。在滅菌的培養(yǎng)皿（D＝90 mm）內(nèi)加入相應(yīng)菌種的固體培養(yǎng)基15 mL~20 mL，制成營養(yǎng)平板，抽取供試菌懸液各100 μL到相應(yīng)菌種的培養(yǎng)平板上，涂抹均勻。然后在每個(gè)營養(yǎng)平板中均勻、平展放入3片濾紙片，在其中2片上分別滴加葡萄柚精油20 μL剩余1片濾紙片加20 μL無菌水作對照。在37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h后，測定大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑，在28℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)48 h后，測定黑曲霉、酵母菌抑菌圈直徑。重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.5 最小抑菌濃度（MIC）

采用連續(xù)稀釋法[3]。以丙酮為溶劑，配制一系列梯度濃度的精油溶液，將該梯度濃度的精油溶液加入已融化好的培養(yǎng)基中，混合均勻，使培養(yǎng)基中含精油的濃度為10.00%、7.50%、5.00%、2.00%、1.00%、0.500%、0.250%。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，平板劃線接種供試菌，按前述條件培養(yǎng)，觀察結(jié)果，每一精油濃度梯度作3組平行試驗(yàn)，與對照組（菌落生長正常）比較，有肉眼可見菌落生長者為無抑制作用，以完全沒有菌落生長的最低精油濃度為其最低抑菌濃度（MIC，the mini－mum inhibitory concentration），以丙酮、無菌蒸餾水作對照，分別測得葡萄柚精油對5種試驗(yàn)菌的MIC值。

1.3.6 室內(nèi)空氣抑菌率

采用自然沉降法測定[4-5]。將滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)、高氏一號培養(yǎng)基傾注在9 cm培養(yǎng)皿中冷卻備用。將長40 cm寬36 cm高35 cm的測試箱在紫外光下滅菌20 min，放置在距地面1.3 m的平臺上。然后將上述制備好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿放入測試箱的底部，打開培養(yǎng)皿上蓋，蓋好測試箱，通過特制的噴灑口向測試箱內(nèi)噴灑100 μL葡萄柚精油，使精油霧化均勻，不要使精油直接噴在培養(yǎng)基上，然后迅速密閉噴灑口，在室溫（24℃左右）下20 min后打開測試箱蓋，蓋上皿蓋，貼上標(biāo)簽。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，高氏一號培養(yǎng)基于28℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，記錄各皿菌落，計(jì)算單位體積抑菌率。以未加精油自然沉降菌落數(shù)為對照。

采用公式Y(jié)=[DS-CS]/DY×100%計(jì)算抑菌率，式中：Y為抑菌率；DS為對菌落數(shù)；CS為精油處理菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾種菌種生長曲線

試驗(yàn)結(jié)果表明：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌生長曲線（圖1）和黑曲霉生長曲線（圖2）均呈“S”形。3種細(xì)菌的對數(shù)生長期：金黃色葡萄球菌為4 h~16 h，大腸桿菌為4 h~14 h；枯草芽孢桿菌為8 h~24 h。在生長速度上，金黃色葡萄球菌最快，大腸桿菌居中，枯草芽孢桿菌最慢。OD值達(dá)0.8時(shí)，3種細(xì)菌所需的時(shí)間也不一致，金黃色葡萄球菌需要培養(yǎng)7h~8h；大腸桿菌需要8h~9h；枯草芽孢桿菌需要13h~14 h（圖1）。酵母菌0~14 h為延滯期，14 h~26 h為對數(shù)生長期，26 h后生長開始衰退。培養(yǎng)對數(shù)生長期中，當(dāng)OD值達(dá)1.2時(shí)需要22 h（圖1）。黑曲霉0~8 h為延滯期，16 h~36 h為對數(shù)生長期，32 h后生長開始衰退（圖2）。以培養(yǎng)20 h時(shí)的菌液作為供試菌液。

2.2 葡萄柚精油的抑菌圈直徑大小

葡萄柚精油對試驗(yàn)用的5種菌種均有很好的抑菌性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、酵母菌的抑菌圈直徑分別為（17.2±1.9）、（9.2±0.7）、（27.1±2.3）、（17.2±2.3）、（18.5±1.6）mm；無菌水對照均為6 mm。其中對枯草芽孢桿菌的抗性最強(qiáng)，對金黃色葡萄球菌的抗性最弱。對試驗(yàn)菌種形成的抑菌圈直徑大小因菌種而異。根據(jù)抑菌圈試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：即抑菌圈徑大于20 mm為極敏；15 mm~20 mm為高敏；10mm~15mm為中敏；7mm~9mm為低敏，小于7mm為不敏感。葡萄柚精油對大腸桿菌、黑曲霉、酵母菌的抑菌程度為高敏；對枯草芽孢桿菌為極敏；對金黃色葡萄球菌為低敏。

2.3 葡萄柚精油對不同菌種的最小抑菌濃度

葡萄柚精油對于枯草芽孢桿菌的抗性最強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到1.00%時(shí)試管中已沒有菌落被檢測出來；其次是大腸桿菌，葡萄柚精油對它的最低抑制濃度為2.00%；黑曲霉的最低抑制濃度為5.000%；對于金黃色葡萄球菌的抗菌性相對最弱，最低抑制濃度為7.500%。

表1 葡萄柚精油對細(xì)菌的最低抑菌濃度Table 1 MIC of essential oil of Yuzu peel oil on Mycorrhizal specie

2.4 葡萄柚精油對空氣中微生物的抑制能力

精油作用20 min，Φ90 cm平皿上自然沉降的落數(shù)和對照菌落數(shù),100 μL葡萄柚精油作用于長40 cm寬36 cm高35 cm的測試箱中，經(jīng)20 min后，將平皿37℃24 h和28℃48 h培養(yǎng)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上沉降的對照菌落數(shù)為55.2 cfu，處理菌落數(shù)30.2 cfu，抑菌率為41.2%。馬鈴薯培養(yǎng)基的真菌對照菌落數(shù)為30 cfu，處理菌落數(shù)15.7 cfu，抑菌率為47.7%。高氏一號培養(yǎng)基上的放線菌菌落數(shù)對照為19.3 cfu，處理菌落數(shù)11.0 cfu，抑菌率為44.9%。100 μL精油作用于0.05 m3體積的室內(nèi)空氣中，使沉降在平皿上的總菌落數(shù)由150.3 cfu減少到59.7 cfu，平均抑菌率為44.6%。

4 結(jié)論

1）葡萄柚精油對幾種空氣、水及食品中常見菌及常見致病菌進(jìn)行了定性抗菌性研究。定性試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法測定了葡萄柚精油對供試菌種生長期的抗菌圈直徑，其中對枯草桿菌抑制作用極敏。對大腸桿菌、酵母菌和黑曲霉抑制作用表現(xiàn)為高敏。對金黃色葡萄球菌的抑制作用表現(xiàn)為低敏。

2）葡萄柚精油具有較好的揮發(fā)性，其揮發(fā)性成分對一般環(huán)境常見枯草芽孢桿菌作用最強(qiáng)，最小抑菌濃度為1.00%；對大腸桿菌和酵母菌的最小抑制濃度都是2.00%；對黑曲霉的最小抑制濃度5.00%；對金黃色葡萄球菌的抑制作用最弱，其最小抑菌濃度為7.500%。

3）對室內(nèi)空氣細(xì)菌的抑制作用,100 μL葡萄柚精油在0.05 m3空間內(nèi)作用20 min，90 mm培養(yǎng)皿中沉降的細(xì)菌、真菌和放線菌的抑菌率分別為41.2%、47.7%和44.9%，總抑菌率為44.6%。

4）葡萄柚精油具有一定的抑菌活性，對5種供試菌中的4種菌種均有較強(qiáng)的抑制作用，只有對金黃色葡萄球菌的抑制作用相對較弱。

因此，葡萄柚精油是一種很有研究價(jià)值和開發(fā)前景的芳香油植物資源，在抗菌，防腐，食品，醫(yī)藥等領(lǐng)域上將會有很好的應(yīng)用前景。

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The Antibacterial Activity Study of Grapefruit Essential Oil

LI Yue，HOU Bin-bin，JING Bao-yuan
（Tianjin Bohai Vocational Technical College，Tianjin 300402，China）

2010-09-28

李悅（1979—），女（漢），講師，本科，研究方向：天然產(chǎn)物提取與開發(fā)。