李仁勇，梁立娜，牟世芬

1(中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100085)

2(戴安中國有限公司應(yīng)用研究中心，北京，100085)

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)食品中糖的應(yīng)用進(jìn)展

李仁勇1，2，梁立娜1，2，牟世芬1

1(中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100085)

2(戴安中國有限公司應(yīng)用研究中心，北京，100085)

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)測(cè)定糖具有靈敏度高，分離效果好，無需衍生等優(yōu)勢(shì)，是糖類分析技術(shù)的一次重要技術(shù)革新。文中重點(diǎn)討論了近十幾年來該檢測(cè)技術(shù)在分析食品中糖方面的應(yīng)用進(jìn)展。

高效陰離子交換色譜，脈沖安培檢測(cè)，食品，糖

糖類物質(zhì)是一類多羥基醛類或酮類化合物及其衍生物或聚合物，是自然界中分布極為廣泛的一類有機(jī)化合物，是生命體維持生命活動(dòng)所需能量的主要來源。糖類化合物還參與許多生命活動(dòng)，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)功能和促進(jìn)代謝等作用。按其結(jié)構(gòu)單元的不同，可分為單糖、低聚糖、多糖、糖系衍生物(典型如糖醇、糖胺、糖醛酸、磷酸化糖等)和結(jié)合糖。不同種類的糖的功能不盡相同，因而準(zhǔn)確測(cè)定食品中各種糖含量很重要。

采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(high performance anion exchange chromatographypulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)測(cè)定糖類，是糖類分析技術(shù)的一次飛躍，該技術(shù)自20世紀(jì)80年代出現(xiàn)并發(fā)展至今已趨于成熟。HPAEC-PAD分析糖，具有樣品前處理簡單，無需衍生，靈敏度高，線性范圍寬，無需有機(jī)溶劑，分離柱效高等優(yōu)勢(shì)，可用于各種食品中的單糖、低聚糖、多糖(單體聚合度＜80)、糖醇、糖胺、糖醛酸及一些其他糖類衍生物的直接分析。隨著美國分析家協(xié)會(huì)(American Organization of Analytical Chemists，AOAC)自1995年以來先后頒布了《AOAC 995.13-速溶咖啡中的糖》，《AOAC 996.04-甘蔗和甜菜糖蜜中的糖》，《AOAC 997.08-食品中的果聚糖》，《AOAC 2000.11-食品中的葡聚糖》，《AOAC 2000.17-粗蔗糖中痕量葡萄糖和果糖的測(cè)定》和《AOAC 2001.02-特定食品中反式低聚半乳糖的測(cè)定》6項(xiàng)食品行業(yè)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法之后，HPAEC-PAD逐步成為糖檢測(cè)的首選方法，在國內(nèi)外食品行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。

1 基本原理

常見糖類物質(zhì)在水中的pKa值見表1。由表1可知，常見單、雙糖和糖醇的pKa值一般在l2～14，常見糖醛酸和糖胺的pKa都小于7。當(dāng)所處堿性溶液的pH值≥l2時(shí)，大多數(shù)糖類化臺(tái)物均能部分或全部以陰離子的形式存在，因而可以采用陰離子交換色譜柱，以強(qiáng)堿性溶液為淋洗液進(jìn)行分離。由于糖分子結(jié)構(gòu)中還存在疏水部分，因而糖的分離機(jī)理除陰離子交換外，還有疏水性吸附作用。糖類化合物在陰離子交換分離柱上的保留能力主要取決于糖類化合物所帶的電荷數(shù)、分子大小、組成和結(jié)構(gòu)[1］。

表1 常見糖類化合物在水中(25℃時(shí))的電離常數(shù)

安培檢測(cè)是通過測(cè)量電化學(xué)活性物質(zhì)在適當(dāng)?shù)氖┘与娢幌掳l(fā)生氧化或還原反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的電流變化從而測(cè)定該物質(zhì)的一種檢測(cè)技術(shù)。糖的分離是在堿性條件下完成，而金電極的檢測(cè)條件通常為堿性，且金電極表面還可為糖的電化學(xué)氧化反應(yīng)提供反應(yīng)環(huán)境，因而金電極檢測(cè)和陰離子交換分離相互間具有良好的匹配性。由于糖的氧化反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)覆蓋在電極表面產(chǎn)生不可逆的污染，因而需選擇不同的施加電位對(duì)電極表面進(jìn)行清洗與活化，使電極能夠連續(xù)工作，即為脈沖安培檢測(cè)。對(duì)糖類化合物的測(cè)定，早期多使用三電位波形。但長期使用發(fā)現(xiàn)在該電位波形下，電極表面容易腐蝕，且重現(xiàn)性較差[1］。Rocklin等[2］于1998年提出了新的四電位波形，大大提高了電極的使用壽命和長期穩(wěn)定性，使得糖檢測(cè)技術(shù)又向前邁進(jìn)一大步。

2 應(yīng)用進(jìn)展

2.1 單糖和雙糖分析

蜂蜜是最常見的天然滋補(bǔ)食品之一，其各種糖分含量是影響蜂蜜質(zhì)量的重要因素。歐盟、美國和日本對(duì)進(jìn)口蜂蜜中葡萄糖、果糖、蔗糖含量都有要求，對(duì)蔗糖含量的要求尤為嚴(yán)格。崔鶴等[3］對(duì)離子色譜-脈沖安培檢測(cè)蜂蜜中葡萄糖、果糖、蔗糖的方法進(jìn)行了研究，采用CarboPac PA1分離柱和脈沖安培檢測(cè)器，50 mol/L NaOH作淋洗液可使蜂蜜中的葡萄糖、果糖、蔗糖得到較好分離和檢測(cè)。由于利益的驅(qū)使，蜂蜜的摻假現(xiàn)象層出不窮，近年來又出現(xiàn)了常規(guī)方法很難判別的植物源性糖漿摻假。Christophe等[4］建立了一套判別蜂蜜糖漿摻假的方法，利用陰離子交換-脈沖安培檢測(cè)分析不同批次和不同程度添加糖漿的蜂蜜樣品中蔗糖和麥芽糖的增減情況，并通過線性判別分析和偏最小二乘法統(tǒng)計(jì)最終判別未知樣品的摻假情況。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，任何以淀粉糖漿喂養(yǎng)蜜蜂得到的蜂蜜也可以根據(jù)此法判別出摻假。

侯玉柱等[5］使用HPAEC-PAD測(cè)定了糕點(diǎn)中水溶性半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖。以水浸提、經(jīng)過脫脂、除蛋白和膜過濾處理糕點(diǎn)樣品，以NaOH溶液梯度淋洗程序在CarboPac PA10陰離子交換柱上分離待測(cè)7種糖，對(duì)于薩其瑪、餅干、面包、蛋糕、酥餅等樣品均具有較好的適用性。該方法目前已被引入到標(biāo)準(zhǔn)方法《GB/T 23780-2009糕點(diǎn)質(zhì)量檢驗(yàn)方法》中作為單、雙糖測(cè)定的第二推薦方法。

牛奶的加熱或者儲(chǔ)藏過久會(huì)引起組分的變化，從而影響它的營養(yǎng)價(jià)值，甚至造成奶制品變質(zhì)。乳果糖是乳糖在牛奶熱處理過程中的異構(gòu)化產(chǎn)物，其含量測(cè)定被國際奶制品組織建議作為評(píng)價(jià)產(chǎn)品是巴氏法滅菌，超熱處理和已滅菌的指示劑，能否分離乳果糖和乳糖并準(zhǔn)確測(cè)定乳果糖的含量極為關(guān)鍵。曾文芳等[6］以5 mmol/L NaOH+1 mmol/L醋酸鈉在CarboPac PA1色譜柱上等度淋洗成功地對(duì)牛奶中的乳糖和乳果糖進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明該方法具有良好的重現(xiàn)性、線性關(guān)系和加標(biāo)回收率，以及較低的檢測(cè)限。

嬰兒配方奶粉的假冒事件常有發(fā)生，Lisa等[7］提出，以離子色譜法測(cè)定乳基、豆基和蛋白水解液配方的嬰兒配方食品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖，找到不同配方食品中糖含量存在的明顯特征，以作為企業(yè)控制產(chǎn)品質(zhì)量的依據(jù)。

此外，食品中的不同種類糖的含量還可以作為貯藏時(shí)間的依據(jù)，例如Cristina等[8］研究了白蘭地在貯藏過程中葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、乳糖和木糖的濃度變化，通過檢測(cè)白蘭地樣品中這些糖類尤其是阿拉伯糖的含量來估算酒的保存時(shí)間，準(zhǔn)確率高達(dá)80%以上。

2.2 低聚糖分析

天然低聚果糖廣泛分布于多種蔬菜和水果中，Homme[9］等研究了CarboPac PA100色譜柱分離脈沖安培檢測(cè)蔗果二糖、蔗果三糖、蔗果四糖、菊粉二糖和菊粉三糖的方法，并通過此方法用于測(cè)定新鮮的蘋果、梨、李子和香蕉以及燴干果中低聚果糖的含量，發(fā)現(xiàn)這些水果中均不含有菊粉三糖和蔗果四糖。Max Feinberg等[10］則利用HPAEC-PAD確定不同加工食品中的蔗果二糖、蔗果三糖、蔗果四糖和三氯蔗糖的糖特性，從而更好對(duì)食品加工過程和質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格控制。

啤酒生產(chǎn)原料中的麥汁含有豐富的糖類物質(zhì)尤其是低聚麥芽糖，通過工藝調(diào)節(jié)控制麥汁中糖的組成可生產(chǎn)出多種風(fēng)味和口感豐富的啤酒產(chǎn)品。潘媛媛等[11］建立的HPAEC-PAD同時(shí)測(cè)定單糖和低聚麥芽糖等11種糖的方法，可應(yīng)用于啤酒和麥汁樣品的糖組分測(cè)定。該方法前處理簡單，檢測(cè)靈敏度高。

低聚半乳糖是一種天然存在于動(dòng)物乳汁中的低聚糖，尤以母乳中含量高，除具有常見低聚糖的功能外，低聚半乳糖具有可被雙歧桿菌發(fā)酵的特性，因而可顯著增殖雙歧桿菌，有效抑制有害病原菌和腐敗菌。Cristina等[12］檢測(cè)了多種市售發(fā)酵酸奶中的3-半乳二糖、6＇-半乳糖基乳糖、3-半乳糖基葡萄糖和3＇-半乳糖基乳糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有雙歧桿菌的酸奶中低聚半乳糖的含量高于含有干酪乳桿菌的即飲酸奶，但均高于不含桿菌的酸奶。此外，低聚半乳糖在4℃保存下含量變化不大，因而其含量可反應(yīng)產(chǎn)品的來源性信息，這將有助于溯源了解生產(chǎn)條件的差異，并最終起到優(yōu)化生產(chǎn)工藝提高產(chǎn)品功能性的作用。

大豆低聚糖是大豆中可溶寡糖的總稱，主要由棉子糖、水蘇糖、蔗糖等組成。此外大豆制品中還含有少量的葡萄糖、果糖和半乳糖等。準(zhǔn)確測(cè)定大豆及大豆制品中糖的組和含量已成為評(píng)價(jià)大豆及其產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值、科學(xué)選種以及大豆制品生產(chǎn)工藝監(jiān)控等必須解決的問題。李仁勇等[13］建立了測(cè)定豆腐水中常見的3種單糖，以及蔗糖、蜜二糖、棉子糖和水蘇糖等大豆低聚糖的方法。以NaOH淋洗液梯度淋洗，7種糖在CarboPac PA 10高效陰離子交換柱上在30 min內(nèi)完成分離，適用于大豆及大豆制品中常見糖組分的分析。

不同來源樣品中低聚糖含量和種類會(huì)存在差異，測(cè)定低聚糖含量可以為外源性摻假提供證據(jù)，近年來公布執(zhí)行的《GB/T 21533-2008蜂蜜中摻假淀粉糖漿的測(cè)定——離子色譜法》就是采用類似方法。由于蜂蜜中不含5糖以上的寡糖，而淀粉糖漿則均含5糖以上的低聚糖，在經(jīng)過凝膠體積排阻法去除樣品中果糖、葡萄糖，將寡糖富集后直接經(jīng)陰離子交換色譜-電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)，5糖以上低聚糖的存在可作為蜂蜜中淀粉糖漿的判定指標(biāo)。若樣品在麥芽五糖和麥芽六糖色譜峰之間、麥芽六糖和麥芽七糖色譜峰之間有2個(gè)典型的“指紋峰簇”P1和P2，則可由此判斷蜂蜜中摻入果葡糖漿。而若摻入麥芽糖漿，在麥芽五糖～麥芽六糖、麥芽六糖～麥芽七糖以及麥芽七糖之后則存在3個(gè)典型的“指紋峰簇”P1、P2和P3[14］。

2.3 多糖分析

由于脈沖安培檢測(cè)法是利用糖在電極表面的氧化還原反應(yīng)直接檢測(cè)，無需衍生且具有極高的靈敏度，給常規(guī)檢測(cè)器上響應(yīng)很低的多糖分析提供了一個(gè)好工具，不斷改進(jìn)的高效離子交換柱技術(shù)已使得聚合度小于80的多糖組成的直接分析成為可能。Kristine等[15］利用Bio-Gel P-6凝膠柱將多糖組分分成不同的聚合度片段分別測(cè)定以確定多糖的分子質(zhì)量組成，并研究了聚合度在3～65的麥芽多糖在安培檢測(cè)器上的響應(yīng)情況，方法應(yīng)用于糯玉米淀粉、小麥粉、馬鈴薯和扁豆樣品中支鏈淀粉的測(cè)定。Haska等[16］則研究了不同品種和產(chǎn)地的小麥粉中的果聚糖情況，通過HPAEC-PAD確定樣品中果聚糖的分子質(zhì)量分布，并發(fā)現(xiàn)不同組分的果聚糖聚合度基本不超過19，且不同分子質(zhì)量的分布情況也類似。

對(duì)于聚合度更高的多糖，更多會(huì)通過適當(dāng)?shù)拿杆饣蛘咚崴馐侄螌⒍嗵欠纸鉃閱误w結(jié)構(gòu)后再檢測(cè)。Anis等[17］研究了3種釀酒葡萄和2種蘋果的果皮中的多糖含量，通過合適的酸水解步驟將果皮多糖轉(zhuǎn)化為一系列單糖和糖醛酸，并由此反推得到果皮中的各種多糖的組成情況。大蒜多糖具有抗氧化、抗病毒等保健作用，歐云付等[18］將大蒜多糖水解為單糖后，在AminoPac PA10陰離子交換色譜柱上，以NaOH溶液淋洗，脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)了鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大蒜多糖主要由果糖和葡萄糖組成，此外還有少部分半乳糖、甘露醇。

羊棲菜為多年生大型海藻，目前在我國南方海區(qū)已經(jīng)大量人工養(yǎng)殖，是重要的出口創(chuàng)匯海藻資源。近年研究表明，羊棲菜多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血脂等作用。王培培等[19］采用高效離子色譜法分析褐藻糖膠中單糖組成，其主要含有巖藻糖，半乳糖，甘露糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖，木糖，葡萄糖胺和甘露糖醛酸。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)選育羊棲菜褐藻膠中古羅糖醛酸、葡萄糖、甘露糖和氨基葡萄糖含量均明顯高于野生羊棲菜，從而為羊棲菜多糖資源的開發(fā)利用提供參考。

2.4 糖醇、糖胺及其他糖類衍生物分析

糖醇是一種多元醇，由糖分子上的醛基或酮基還原成羥基而成。因其具有不產(chǎn)生齲齒、對(duì)血糖值上升無影響，且能為糖尿病人提供一定熱量，所以作為營養(yǎng)性甜味劑，廣泛應(yīng)用于無糖食品行業(yè)中。唐坤甜等[20］建立了同時(shí)分析無糖食品中的糖和糖醇的HPAEC-PAD方法，檢測(cè)了14種無糖食品和低糖食品中的丙二醇、肌醇、甘油、木糖醇、山梨醇、甘露醇、半乳糖醇、葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖等12種糖，借以有效控制無糖食品的質(zhì)量，規(guī)范無糖食品市場(chǎng)。通過CarboPac MA1與CarboPac PA10兩種色譜柱的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

二糖醇如麥芽糖醇，異麥芽糖醇和乳糖醇具有負(fù)熱量、低吸濕性，高穩(wěn)定性和良好的膨脹性等特點(diǎn)，越來越多的用于食品工業(yè)。Tommaso等[21］研究了麥芽糖醇、異麥芽糖醇、乳糖醇，以及其他常見糖類在CarboPac PA 100色譜柱上的同時(shí)測(cè)定方法，使用40 mmol/L NaOH和1 mmol/L醋酸鋇為流動(dòng)相，脈沖安培法檢測(cè)。加入醋酸鋇化學(xué)消除淋洗液中碳酸根，以期獲得滿意的重現(xiàn)性，并有效改善分離和峰形靈敏度。另外由于等度淋洗且無需柱再生，在此條件下樣品分析時(shí)間可控制在25 min內(nèi)。方法能夠適用于太妃糖果、餅干、巧克力等十幾種食品的二糖醇測(cè)定。

Tommaso等[22］開 發(fā) 了12 mmol/L NaOH和1 mmol/L醋酸鋇等度分離洗脫肌醇、半乳糖醇、甘露醇、半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖和水蘇糖的色譜條件，并成功應(yīng)用于橄欖根和葉的純水提取物中水溶性糖類化合物的分析。該方法的創(chuàng)新之處在于，在短短25 min內(nèi)等度分離了肌醇、糖醇、常見單糖、雙糖以及三糖(棉子糖)和四糖(水蘇糖)。

糖胺是糖的羥基為氨基所取代的一類化合物的總稱，常見的主要是葡萄糖胺。葡萄糖胺為組成關(guān)節(jié)軟骨的主要營養(yǎng)成分，具有促進(jìn)形成關(guān)節(jié)軟骨組織，預(yù)防關(guān)節(jié)炎發(fā)生的作用，常添加在有益于關(guān)節(jié)健康的膳食中。張思維等[23］以AminoPac PA 10陰離子交換色譜柱分離，金電極脈沖安培檢測(cè)了葡萄糖胺。所建立的方法的線性范圍寬，檢出限達(dá)0.01 mg/L，而與其共存的糖類對(duì)葡萄糖胺的測(cè)定基本不存在干擾，可適合于各種保健食品中葡萄糖胺的準(zhǔn)確分析。

唾液酸是一種存在于高等動(dòng)物體內(nèi)的氨基九碳糖，在多方面起到重要的生理功能，例如母乳中唾液酸成分能幫助嬰兒抵抗腸道感染并促進(jìn)智力發(fā)育。唐坤甜等[24］建立了陰離子交換色譜分離-脈沖安培檢測(cè)測(cè)定牛乳及制品中2種常見唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的方法。實(shí)驗(yàn)中利用優(yōu)化的酸水解法將唾液酸從低聚糖和糖蛋白中釋放出來，并以 CarboPac PA20陰離子交換柱作分離柱，在NaOH和醋酸鈉淋洗液梯度淋洗下20 min內(nèi)可完成分析。此方法被應(yīng)用于15種牛乳和牛乳制品的唾液酸分析中。

三氯蔗糖是一種蔗糖的氯代產(chǎn)物，是近年來興起的一種添加于食品飲料中的非營養(yǎng)性甜味劑。VALORAN等[25］結(jié)合了高效陰離子交換和脈沖安培檢測(cè)器這兩種產(chǎn)品，開發(fā)了10min等度分離三氯蔗糖的測(cè)定條件，并應(yīng)用于一種添加人造甜味劑三氯蔗糖的紅樹莓軟飲料中三氯蔗糖的分析。若要同時(shí)分析樣品中的其他糖類，則需要使用時(shí)間稍長的梯度條件分離。

3 結(jié)論

經(jīng)過20多年的發(fā)展，HPAEC-PAD檢測(cè)糖類化合物的分析檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)趨于成熟和完善，可用于各種食品中的單糖、低聚糖、多糖、糖醇、糖胺、糖醛酸以及其他糖類衍生物的分析。相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，HPAEC-PAD法具有無需衍生，高靈敏度，線性范圍寬，色譜柱分離高效等特點(diǎn)。伴隨著離子色譜儀的普及，會(huì)越來越多地應(yīng)用于食品中各種糖的分析，并且在相關(guān)糖類檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)方法制訂中有所體現(xiàn)。

此外，HPAEC-PAD法檢測(cè)糖成分時(shí)因?yàn)殪`敏度高而不會(huì)丟失低含量糖組分的信息，研究低聚糖和多糖組成時(shí)信息更為全面。食品中的低聚糖分析，植物、動(dòng)物和真菌多糖的分子量分布和結(jié)構(gòu)研究近期還將是發(fā)展重點(diǎn)，而這些研究很可能會(huì)進(jìn)一步借助離子色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)更好地對(duì)這些糖進(jìn)行定性和定量。

伴隨著分離度更優(yōu)的色譜柱乃至毛細(xì)管柱、整體柱等的研究，穩(wěn)定、可靠的新型脈沖安培檢測(cè)器和新型電極材料的研制，高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)糖分析技術(shù)具有更為廣闊的應(yīng)用空間。

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ABSTRACTDetermination of carbohydrates with High Performance Anion Echange Chromatography-Pulsed Amperometric Detection(HPAEC-PAD)is a important technological innovation to carbohydrates analysis techniques for its high sensitivity，good separation，no derivatization and other advantages.This article focused on the advance in the application for over a decade in food carbohydrates analysis with this method.

Key wordshigh performance anion exchange chromatography，pulsed amperometric detection，food，carbohydrates

Application Advance in Analysis of Food Carbohydrates with High Performance Anion Exchange Chromatography-pulsed Amperometric Detection

Li Ren-yong1，2，Liang Li-na1，2，Mou Shi-fen1
1(State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology，Research Center for Eco-Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085，China)
2(Application Research Center，Dionex China，Beijing 100085，China)

碩士，助理工程師。

2010-06-29，改回日期:2010-07-01