周 歡,李敬芬,戚肆朝,徐純夏,宋國鑫,余騰飛,劉建華

(湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,浙江湖州313000)

正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選浙貝母總＊生物堿提取分離工藝

周 歡,李敬芬,戚肆朝,徐純夏,宋國鑫,余騰飛,劉建華

(湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,浙江湖州313000)

為了優(yōu)化浙貝母中生物堿提取條件,比較了影響生物堿提取率諸因素,并利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)中的正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取條件.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用浙貝母粉末重量30倍的55%乙醇(W/V)為提取溶劑,結(jié)合搖床振蕩法,振蕩速度為150r/min,提取24h,經(jīng)氯仿萃取,生物堿的提取率最高.用D1300大孔樹脂,95%乙醇溶液作為洗脫劑,上樣p H為9.0,原液濃度為0.1mol/L時(shí)為最佳純化條件.本試驗(yàn)篩選提取方法可作為貝母中生物堿提取的一種較好選擇.

浙貝母;生物堿;提取;純化

0 引言

浙貝母為百合科貝母屬浙貝母(Fritillaria thunbergii M iq.)干燥鱗莖,其主要活性成分為生物堿,含浙貝甲素、浙貝乙素、貝母辛、貝母酚等[1].據(jù)李萍等[2]研究,浙貝母總生物堿對小鼠氨水引咳有鎮(zhèn)咳作用.錢伯初等[3]證實(shí)浙貝母堿和去氫浙貝母堿為浙貝母鎮(zhèn)咳有效成分.

用大孔樹脂純化生物堿可避免引入雜質(zhì)[4].如用大孔樹脂提取喜樹堿可得到含約50%的產(chǎn)品,重結(jié)晶后含量可達(dá)90%[5],表明這是一種有效的分離方法.

目前,浙貝母總生物堿純化工藝和質(zhì)量控制及活性研究方面有待改進(jìn),本試驗(yàn)擬通過正交實(shí)驗(yàn)[6,7],以總生物堿保留率和純度為參數(shù),用大孔吸附樹脂對浙貝母總生物堿提取分離工藝進(jìn)行研究,選出浙貝母生物堿分離純化最佳工藝,為實(shí)現(xiàn)浙貝母總生物堿工業(yè)化大生產(chǎn)及其質(zhì)量控制,為申報(bào)生物堿為主要藥效物質(zhì)的新藥,促進(jìn)浙貝母總生物堿深入研究奠定基礎(chǔ).

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、DZG-6050型真空干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、FZ102微型植物粉碎機(jī)、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠).

1.2 材料

浙貝母(購自杭州中藥飲片廠)、D101大孔吸附樹脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、LD605型樹脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、D1300大孔樹脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).氯仿、95%乙醇、鹽酸、濃氨水、碘化鉍鉀試劑等均為分析純.標(biāo)準(zhǔn)對照品:浙貝甲素(購自浙江省藥品檢驗(yàn)所).

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 總生物堿提取工藝優(yōu)化研究

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取10mg浙貝甲素標(biāo)準(zhǔn)品于10m L氯仿配成母液,用母液制成含浙貝甲素0～120Λg標(biāo)準(zhǔn)品溶液,以20Λg為一梯度.用100Conc紫外分光光度計(jì),波長618.0 nm測吸光度(A).最小二乘法得回歸方程:A= 0.087 8C-0.074 3(R=0.999 6).

2.1.2 生物堿提取與測定

將直徑3～6cm的浙貝母鮮球莖置烘箱,于80℃烘24h,再用FW 2100型高速萬能粉碎機(jī)研成粉末.稱1g浙貝母粗粉2份,分別置100m L錐形瓶中,并各加入40m L 95%乙醇,分別于室溫冷浸和搖床振蕩提48h,得粗提液,用中速定性濾紙過濾,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,醇提物用2%鹽酸溶解,過濾,濾液用濃氨水調(diào)節(jié)p H至11,再用氯仿萃取4次,每次20m L,萃取液經(jīng)減壓濃縮稱取浸膏重.再用氯仿定容至1m L,用分光光度計(jì)測吸光度,按標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程算生物堿含量.

2.1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

擬定4個(gè)因素,每個(gè)因素3個(gè)水平,按L9(34)正交設(shè)計(jì)表(見表1)確定方案,找出的最優(yōu)生物堿提取組見表2.

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.2 浙貝母總生物堿的純化工藝

2.2.1 樹脂處理

3種型號大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24h,濕法裝柱,95%乙醇沖洗樹脂至流出液與水(1∶5)混合無混濁,用水沖洗至流出液無醇味并排除氣泡備用.

2.2.2 上樣液制備及預(yù)處理

取浙貝母粗粉,照最佳工藝條件提取,提取液用適當(dāng)方法除雜,為上樣液.

2.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

取50 m L浙貝母試樣,依表4,用5%NaOH溶液調(diào)p H,以2 mL/min流速吸附,再用8 m L蒸餾水以同樣的流速沖洗樹脂至流出液無色.再用低濃度乙醇以2 mL/min流速進(jìn)行解吸附洗脫,用95%乙醇洗脫,以改良碘化鉍鉀試劑檢測終點(diǎn).收集95%乙醇洗脫液,減壓濃縮,60°C真空干燥至恒重,精密稱重,并依下面的方法測總生物堿質(zhì)量,計(jì)算保留率和生物堿含量.

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響貝母總生物堿在大孔吸附樹脂上吸附與洗脫的主要因素有:上樣p H、吸附樹脂類型、原液濃度及洗脫劑對吸附影響,見表3、表4.

表3 大孔吸附樹脂上吸附洗脫的正交因素水平表

表4 大孔吸附樹脂上吸附洗脫的正交實(shí)驗(yàn)表

保留率=樣品中總生物堿含量(g)/湖北貝母藥材中總生物堿重量(g).

樣品中總生物堿含量=樣品中總生物堿質(zhì)量(g)/樣品重量(g).

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 總生物堿提取工藝優(yōu)化研究

我們對總生物堿的兩種提取法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)比較,指標(biāo)是浸膏量和生物堿含量,以便篩選出較好的提取方法.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5.

表5 不同提取方法比較

據(jù)表5,采用搖床振蕩法提取的生物堿含量較高,故正交試驗(yàn)采用該方法進(jìn)行提取.

正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表2,從表2可以看出,提取率最高為A3B3C3D3,因素影響主次為B、C、A、D.分析知,用搖床震蕩浸提,轉(zhuǎn)速150r/min,30倍量55%乙醇提取8次,每次72h為最佳提取.

3.2 浙貝母總生物堿的純化工藝研究

從產(chǎn)品總生物堿含量結(jié)果分析,最佳工藝條件是A2B2C2D3.四因素對實(shí)驗(yàn)影響大小為C>D>B>A.從產(chǎn)品總生物堿保留率結(jié)果分析,最佳工藝條件是A2B2C2D2.四因素對實(shí)驗(yàn)影響大小為A>B>C>D.

鑒于上樣p H值、吸附樹脂類型、原液濃度、洗脫劑對產(chǎn)品總生物堿保留率均無顯著性影響,故主要考察各因素對產(chǎn)品中總生物堿含量的影響,最終確定最佳工藝組合為A2B2C2D3,即選上樣p H值為9,吸附樹脂類型為D1300大孔樹脂,原液濃度為0.1mo l/L,洗脫劑為95%乙醇.

[1]張建興,勞愛娜,徐任生.浙貝母新鮮鱗莖化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志,1993,18(6):354～355,382.

[2]李萍,季暉,徐國鈞,等.貝母類中藥的鎮(zhèn)咳祛痰作用研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1993,20(6):360～362.

[3]錢伯初,許衡鈞.浙貝堿和去氫浙貝堿的鎮(zhèn)咳鎮(zhèn)靜作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1985,20(4):306～308.

[4]張紅,童明容,潘繼倫,等.大孔吸附樹脂提取喜樹堿的研究[J].離子交換與吸附,1995,8(2):145～150.

[5]羅集鵬,馬紅文,許敏青,等.大孔樹脂用于小檗堿的富集與定量分析[J].中藥材,2000,21(7):413～415.

[6]何惟勝.試論中藥制劑工藝優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[J].基層中藥雜志,2001,29(2):46～48.

[7]丁春霞,屠善軍,應(yīng)敏.浙貝母中生物堿提取方法以及條件的優(yōu)化[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2004,18(2):28～30.

Abstract:To op timize the condition for extraction of alkaloids in f ritillaria thunbergiimiq.,we have investigated several possible facto rs affecting the rate of extract ion of alkaloids in fritillaria thunbergiim iq and use the orthogonal design method to op timize the condition.Our results show that the highest rate of extraction of alkaloidswasobtained by using 55%ethanol thirty times versus samp le(v/w),in combination of gyratory shaker,and ethyl acetate.With D1300macroporous resin,95%ethanol solution aseluting agent,the kind of p H 9.0,stock solution concentration of 0.1 as the best purification conditions. Thismethod is a good and alternative choice in the extraction of alkaloids.

Key words:fritillaria thunbergiimiq.;alkaloid;extraction;purification

The Orthogonal Design Method of Optimal Fritillaria Thunbergii M iq.Total Alkaloid Extraction Separation Process

ZHOU Huan,L IJing-fen,Q ISi-chao,XU Chun-xia,SONG Guo-xin,YU Teng-fei
(Faculty of Life Science,Huzhou Teachers College,Huzhou 313000,China)

R284.2

A

1009-1734(2010)02-0056-04

2010-02-20

浙江省教育廳科研項(xiàng)目(20070487);2010年浙江省新苗人才計(jì)劃(BZ04001).

周歡,湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2008級本科生,從事天然有效成分提取研究.