劉敏豐,高志光,秦環(huán)龍

(1.江蘇省無錫市第三人民醫(yī)院消化科,江蘇無錫,214041;2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院,上海,200233)

在膿毒癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷和外科大手術(shù)后,機(jī)體以明顯的代謝紊亂為特征,表現(xiàn)為糖和脂的利用障礙,而蛋白則處于高分解代謝狀態(tài),骨骼肌蛋白大量消耗,肌肉萎縮,疲乏無力,這種現(xiàn)象稱之為肌肉惡病質(zhì)。當(dāng)前對于感染后肌肉降解的分子機(jī)制并不明確,本文探討膿毒癥時肌肉惡病質(zhì)發(fā)生的分子機(jī)制,為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組

雄性SD大鼠20只(復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供,清潔級),體重250～320 g。隨機(jī)分為2組:正常組和膿毒癥組,每組10只。采用盲腸結(jié)扎穿孔法1(CLP)建立膿毒癥動物模型。正常鼠食喂養(yǎng)5天,在氯胺酮腹腔注射麻醉(40 mg/kg)下,分別采集門靜脈血和趾長伸肌組織行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

①氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司;②兔抗大鼠泛素多抗體,美國Dako公司;③Envision試劑,美國Dako公司;④大鼠TNF-α、IL-1、IL-6、皮質(zhì)醇試劑盒(ELISA法),美國DSL公司;⑤Agi-Lent高效液相色譜儀;⑥醫(yī)學(xué)圖像分析軟件,上海申騰信息技術(shù)有限公司;⑦iCycLer定量PCR儀,美國 Bio-Rad公司;⑧DNA thermaL CycLer 480 PCR 儀,美國Perkin EmLer公司 。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

血清細(xì)胞因子和皮質(zhì)醇濃度測定:①于術(shù)后第6天,大鼠在腹腔麻醉下,打開腹腔,取門靜脈血1 mL,離心(2 000 rpm,5 min),取血清,備用;②采用雙抗夾心ELISA法,根據(jù)相應(yīng)試劑盒操作步驟,分別對標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品進(jìn)行反應(yīng);③根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;④根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測樣品濃度。

高效液相色譜-熒光檢測法檢測趾長伸肌組織內(nèi)三甲基組氨酸(3-MH)濃度:①無菌、快速分離大鼠趾長伸肌稱重后,高速勻漿并離心,吸取上清液,待用;②配制氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液,終濃度250 pmoL/μ L;③柱前衍生;④色譜條件:流動相采用10 mmoL/L磷酸鈉緩沖液(含30%乙腈,pH 7.50),等度洗脫,流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量100 μ L;柱溫:室溫;熒光檢測波長:激發(fā)365 nm,發(fā)射460 nm;⑤利用3-MH標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線;⑥根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

電鏡觀察骨骼肌纖維超微結(jié)構(gòu):活體快速采取大鼠趾長伸肌組織,用刀片修整成1 mm 3小塊后,2.5%戊二醛固定,放置4℃冰箱保存。統(tǒng)一脫水后用環(huán)氧樹脂618包埋,超薄制片,定位,醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色,利用透射電鏡觀察骨骼肌纖維大體形態(tài)和胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器改變。

免疫組化檢測骨骼肌泛素蛋白:①取大鼠趾長伸肌組織,常規(guī)福爾馬林固定,脫水,透明,石蠟包埋和切片,采用Envision兩步免疫組化法檢測泛素蛋白水平表達(dá)。②結(jié)果觀察:OLYMPUS BH2顯微鏡,陽性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色,并呈顆粒狀,背景為藍(lán)色;③數(shù)碼拍照后計(jì)算機(jī)圖像處理:數(shù)碼照片使用 PANASONIC MV-CP410相機(jī)拍攝;采用IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng),醫(yī)學(xué)圖像分析軟件,在相同放大倍數(shù)(200)下,于各組切片中隨機(jī)選取9個視野,計(jì)算平均陽性指數(shù),陽性指數(shù)=每視野顯色陽性面積×每視野光密度值(OD)。

實(shí)時熒光定量PCR(reaL-time qPCR)檢測大鼠骨骼肌泛素mRNA:①引物和探針見表1;②取大鼠趾長伸肌組織,放入研缽中加液氮研磨成粉末;③利用 TrizoL試劑盒一步法提取總RNA;④逆轉(zhuǎn)錄;⑤相同條件下分別對標(biāo)準(zhǔn)品PGEMT質(zhì)粒和待測樣品進(jìn)行實(shí)時熒光qPCR;⑥根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的已知濃度和結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;⑦根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別算出樣本的檢測指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,然后計(jì)算各樣本的檢測指標(biāo)與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度的比值作為結(jié)果。

表1 引物和Taqman探針

2 結(jié) 果

體重變化:實(shí)驗(yàn)前后,膿毒癥組大鼠體重明顯下降(43.5±5.80 g)。

血清細(xì)胞因子和皮質(zhì)醇濃度:與正常組相比,膿毒癥組大鼠血清細(xì)胞因子和皮質(zhì)醇濃度均明顯升高(P<0.01),見表2。

表2 血清細(xì)胞因子和皮質(zhì)醇濃度

趾長伸肌組織3-MH濃度:膿毒癥組大鼠3-MH濃度(8.85±0.30 nmoL/g)明顯高于正常組(4.53±0.18 nmoL/g),差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

電鏡骨骼肌纖維形態(tài)學(xué)檢測:透視電鏡下觀察可見正常對照組大鼠趾長伸肌肌小節(jié)完整,肌絲排列整齊,線粒體呈桿狀,嵴完整。膿毒癥組大鼠趾長伸肌鏡下可見肌原纖維排列松散,線粒體腫脹、破裂,部分肌小節(jié)肌絲溶解。

骨骼肌泛素蛋白表達(dá):免疫組化圖像和圖像分析結(jié)果顯示,與正常組相比,膿毒癥組大鼠趾長伸肌組織泛素蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01),見表3。

表3 圖像分析結(jié)果

骨骼肌泛素mRNA表達(dá):膿毒癥組大鼠趾長伸肌組織泛素mRNA表達(dá)(0.426±0.042)明顯高于正常組(0.112±0.014),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

在膿毒癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷和外科大手術(shù)后,機(jī)體以明顯的代謝紊亂為特征,表現(xiàn)為糖和脂的利用障礙,而蛋白則處于高分解代謝狀態(tài),骨骼肌蛋白大量消耗,肌肉萎縮,疲乏無力,這種現(xiàn)象稱之為肌肉惡病質(zhì)。由于肌肉是機(jī)體最大的蛋白質(zhì)儲存庫,肌肉蛋白的消耗將占據(jù)機(jī)體蛋白丟失的重要部分,持續(xù)而嚴(yán)重的肌肉消耗會導(dǎo)致明顯的肌原纖維水解增加,引起肌肉萎縮和耗竭,不利于患者的疾病恢復(fù),如累及呼吸肌,持續(xù)的人工呼吸支持又會增加相關(guān)的呼吸道并發(fā)癥[1-2],從而增加外科危重患者的死亡率。

不同原因致臨床肌肉惡病質(zhì)發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制和分子調(diào)節(jié)機(jī)制基本類似。其中蛋白合成減少和氨基酸攝入減少雖然也是造成骨骼肌代謝反應(yīng)異常的原因,但蛋白降解增加,尤其是肌原纖維蛋白質(zhì)中的肌動蛋白和肌球蛋白的降解增加是導(dǎo)致肌肉惡病質(zhì)的最重要原因。而泛素-蛋白酶體途徑在多種蛋白質(zhì)的降解過程中發(fā)揮著重要作用,而且具有高度的特異性。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),由各種原因如膿毒癥、燒傷、腎衰竭以及腫瘤等所引起的骨骼肌代謝障礙中,泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解起著不容忽視的主導(dǎo)作用。

泛素是含有76個氨基酸殘基的多肽,分子量約8.5 ku,屬高度保守蛋白。1975年首先從小牛的胰腺中分離出來,因廣泛存在于各種真核細(xì)胞和組織中而得名。

膿毒癥時骨骼肌蛋白的降解增加是由泛素-蛋白酶體途徑被激活而造成的。1994年,Tiao等[3]通過研究大鼠盲腸結(jié)扎穿孔模型研究了不同細(xì)胞內(nèi)蛋白水解通路在膿毒癥時骨骼肌蛋白降解中的作用,發(fā)現(xiàn)溶酶體途徑和鈣/鈣激活蛋白酶途徑介導(dǎo)的蛋白水解在正常組和膿毒癥組差異不大,而泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的蛋白水解在膿毒癥組的總體蛋白降解和肌纖維蛋白降解分別增加172%和440%,膿毒癥組大鼠泛素mRNA也相應(yīng)增加了數(shù)倍,結(jié)果顯示膿毒癥骨骼肌蛋白降解中起主導(dǎo)地位的是泛素-蛋白酶體途徑。而國內(nèi)柴家科等[4]也研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥大鼠骨骼肌組織中的泛素和泛素化蛋白的表達(dá)明顯上調(diào),而且與肌纖維蛋白降解率在時相上呈協(xié)同增強(qiáng)作用。

一些細(xì)胞因子和糖皮質(zhì)激素是膿毒癥肌肉惡病質(zhì)時最重要的調(diào)節(jié)因子,有研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠血漿中糖皮質(zhì)激素水平顯著增高[5];實(shí)驗(yàn)大鼠給予地塞米松后伸趾長肌蛋白分解率顯著升高,且呈量-效關(guān)系[6];另有報道由膿毒癥或外傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的肌肉降解可以通過給予糖皮質(zhì)激素受體阻滯劑RU38486得以減輕[7]。一般認(rèn)為糖皮質(zhì)激素是通過激活泛素-蛋白酶體途徑而促進(jìn)肌蛋白降解的。細(xì)胞因子對肌肉惡病質(zhì)的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不明了,但多數(shù)學(xué)者還是肯定了其與肌肉惡病質(zhì)的關(guān)系。與肌蛋白降解有關(guān)的細(xì)胞因子主要有TNF、IL-1和IL-6。有研究認(rèn)為,這些細(xì)胞因子能直接增強(qiáng)骨骼肌局部組織中溶酶體內(nèi)不同組織蛋白酶的活性而導(dǎo)致其蛋白質(zhì)分解代謝增強(qiáng)。也有研究表明這些細(xì)胞因子通過激活肌組織中的泛素-蛋白酶體活性來增強(qiáng)其降解而起間接作用。應(yīng)用細(xì)胞因子的拮抗劑如己酮可可堿和蘇拉明可以明顯降低泛素-蛋白酶體途徑和鈣/鈣激活蛋白酶途徑的活性,減少肌蛋白的降解[8]。

本實(shí)驗(yàn)對膿毒癥骨骼肌降解發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了初步研究,通過免疫組化和reaL-time qPCR分別檢測大鼠趾長伸肌組織泛素蛋白和泛素mRNA表達(dá),利用電鏡技術(shù)觀察骨骼肌纖維超微結(jié)構(gòu)變化,采用高效液相色譜-熒光法檢測趾長伸肌組織內(nèi)3-MH濃度,3-MH是一種只存在于肌肉肌動蛋白和肌凝蛋白的氨基酸,由于分解代謝時釋放產(chǎn)生的3-MH不再參與骨骼肌細(xì)胞新蛋白的合成,故其釋放量可間接反映肌纖維蛋白的降解情況。結(jié)果顯示膿毒癥組大鼠骨骼肌組織內(nèi)泛素蛋白和泛素mRNA表達(dá)明顯上調(diào),而且增加明顯,電鏡下表現(xiàn)為分解代謝旺盛,而3-MH濃度也隨之明顯增加,提示肌纖維蛋白降解增強(qiáng),同時證實(shí)骨骼肌蛋白的降解與泛素-蛋白酶體途徑關(guān)系密切,泛素-蛋白酶體途徑在膿毒癥大鼠骨骼肌降解過程中可能起著關(guān)鍵性作用。

本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)膿毒癥組大鼠血清內(nèi)皮質(zhì)醇、TNF-α、IL-1和IL-6濃度較正常組明顯升高,提示皮質(zhì)醇、TNF-α、IL-1和 IL-6可能在膿毒癥肌肉惡病質(zhì)的發(fā)生發(fā)展過程中起著直接或間接的調(diào)節(jié)作用,具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

[1]Steiger E.A technique for Long term intravenous feeding in unrestrained rats[J].Arch Surg,1972,104(3):330.

[2]HasseLgren,Per-OLof MD.MuscLe cachexia:current concepts of intraceLLuLar mechanisms and moLecuLar reguLation[J].Ann Surg,2001,233(1):9.

[3]Tiao G,Fagan JM,SamueLs N,et al.Sepsis stimuLates nonLysosomaL,energy-dependent proteoLysis and increases ubiquitin mRNA LeveLs in rat skeLetaL muscLe[J].J CLin Invest,1994,94:2255.

[4]柴家科,吳焱秋.膿毒癥對大鼠骨骼肌組織泛素及泛素化蛋白表達(dá)的影響[J].中華外科雜志,2001,39(9):721.

[5]柴家科,吳焱秋.膿毒癥對不同類型骨骼肌蛋白降解率的影響及其機(jī)制初探[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2001,13(5):272.

[6]申傳安,柴家科.糖皮質(zhì)激素對大鼠骨骼肌蛋白分解代謝的影響及其機(jī)制探討[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2002,14(7):428.

[7]HasseLgren,-P-O.MoLecuLar reguLation of muscLe cachexia:it may be more than the proteasome[J].Biochem-Biophys-Res-Commun,2002,290(1):1.

[8]CosteLLi-P,BossoLa-M.Anticytokine treatment prevents the increase in the activity of ATP-ubiquitin-and Ca2+-dependent proteoLytic systems in the muscLe of tumour-bearing rats[J].Cytokine,2002,19(1):1.