何國振,周 妹,湯麗云,馬力敏,徐鴻華

1廣州中醫(yī)藥大學中藥學院,廣州 510006;2華南農業(yè)大學生命科學學院,廣州 510642

不同成熟期梔子果實有效成分累積的研究

何國振1＊,周 妹1,湯麗云2,馬力敏1,徐鴻華1

1廣州中醫(yī)藥大學中藥學院,廣州 510006;2華南農業(yè)大學生命科學學院,廣州 510642

根據(jù)果實顏色可以將梔子成熟期劃分為全青期、2/3青 1/3黃期、半青半黃期、1/3青 2/3黃期、全黃期、枯黃期。采用 HPLC法測定梔子果實在不同成熟時期 3種主要有效成分梔子苷、綠原酸、西紅花苷-1的含量。結果表明:梔子苷、綠原酸、西紅花苷-1含量均出現(xiàn)兩個高峰期,峰形陡峭;高峰出現(xiàn)的時期不完全一致。梔子苷的含量在全青期和 1/3青 2/3黃期最高,而西紅花苷-1的含量在全青期和全黃期最高。全青期為梔子苷和西紅花苷-1的最佳采收期。根據(jù)果實顏色及時采收才能獲得高含量的目標活性成分。

梔子苷;綠原酸;西紅花苷-1;最佳采收期;含量測定

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasm inoidesEllis的干燥成熟果實,具有瀉火除煩,清熱利尿,涼血解毒等功效[1]。化學成分研究表明,梔子中含有 3類主要有效成分,即環(huán)烯醚萜苷類,有機酸類和色素類。梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1分別為 3類成分的主要物質[2]。為了獲得高含量梔子有效成分,近年來人們研究了不同采收期對梔子苷含量的影響[3,4],認為不同采收期梔子中梔子苷、熊果酸的含量有顯著變化,并各自對合理采收期提出了不同的建議。梔子質量的優(yōu)劣應是多種成分的綜合表現(xiàn)。從梔子果實的不同發(fā)育期研究其主要藥效成分的動態(tài)變化規(guī)律,對控制梔子的質量具有重要意義。

梔子果實的體積達到最大后,進入成熟期。整個成熟期的梔子果實顏色經(jīng)歷全青到枯黃的變化。本文以梔子果實不同顏色細分其成熟期,測定果實中梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1等 3種成分的含量,探索這些成分的動態(tài)變化規(guī)律,為科學確定梔子的采收期、獲得高含量有效成分梔子作參考。本研究未見報道。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC2000高效液相色譜輸液泵;L2030紫外檢測器;L2200自動進樣器;T2000P色譜工作站 (上海天美科學儀器有限公司)。

1.2 試劑

梔子苷,綠原酸和西紅花苷-1對照品購自中國藥品生物制品檢定所,批號分別為 110749-200613, 110753-200413,111588-200501。乙腈為色譜純(Merck,Ger many),其余試劑均為分析純。

1.3 樣品

不同顏色的梔子果實于 2008年 10月 21日采自廣東省梅州市平遠縣黃花陂梔子 GAP基地。在約 120株植株上隨機采集各顏色果實,混合后按顏色分成 6組,即:全青 (1)、2/3青 1/3黃 (2)、半青半黃 (3)、1/3青 2/3黃 (4)、全黃 (5)、枯黃 (6)(見彩圖)。原植物經(jīng)作者鑒定為茜草科植物梔子Gardenia jasm inoidesEllis。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱 PhenomenexLuna C18(25 mm×4.6 mm, 5μm),SecurityGuard Analytical(KJ0-4282)。梔子苷:流動相乙腈-水(15∶85),檢測波長 238 nm,流速1.0 mL/min;綠原酸:流動相乙腈-0.4%磷酸 (13∶87),檢測波長 327 nm,流速 0.8 mL/min;西紅花苷-1∶流動相乙腈-水 (23∶77),檢測波長 440 nm,流速1.0 mL/min。柱溫均為室溫。對照品及樣品的分離情況見圖 1～3。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1對照品適量,于容量瓶中分別加入甲醇、70%甲醇和 50%甲醇制成含梔子苷 0.202 mg/mL、綠原酸 0.03384 mg/ mL和西紅花苷-1 0.0654 mg/mL的對照品溶液。

圖 1 梔子苷對照品和梔子樣品HPLC圖譜Fig.1 Typical HPLC chromatograms of authentic geniposide and the extract ofGardenia jasm inoidesEllis.

2.3 供試品溶液的制備

梔子經(jīng)干燥后粉碎,過四號篩,得梔子粉末。

2.3.1 梔子苷樣品溶液的制備

精密稱取梔子粉末 0.1 g,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇 25.0 mL,加塞,稱重。超聲處理 20 min,冷卻,再稱重。用甲醇補足失重,搖勻。進樣前用0.45μm微孔濾膜過濾。

2.3.2 綠原酸樣品溶液的制備

精密稱取梔子粉末 0.5 g,置于具塞錐形瓶中,加入 70%甲醇 25.0 mL,加塞,稱重。超聲處理 20 min,冷卻,再稱重。用 70%甲醇補足失重,搖勻。進樣前用 0.45μm微孔濾膜過濾。

2.3.3 西紅花苷-1樣品溶液的制備

精密稱取梔子粉末 0.1 g,置于具塞錐形瓶中,加入 50%甲醇 25.0 mL,加塞,稱重。超聲處理 40 min,冷卻,再稱重。用 50%甲醇補足失重,搖勻。進樣前用 0.45μm微孔濾膜過濾。

2.4 線性范圍考察

精密吸取梔子苷對照品溶液 1、3、7、10、20μL,綠原酸對照品溶液 1、5、10、15、20μL,西紅花苷-1對照品溶液 1、3、7、10、20μL,進樣,測定色譜峰面積,以進樣量(X)對峰面積(Y)進行線性回歸,回歸方程如表 1。

表 1 3種活性化合物的回歸曲線(n=5)Table 1 Calibration curve for the three active compounds(n=5)

2.5 精密度試驗

精密吸取上述各對照品溶液 10μL,連續(xù)進樣 6次,以各成分峰面積計算 RSD,所得結果:梔子苷0.47%,綠原酸 2.47%,西紅花苷-1 1.95%。結果表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取上述各對照品溶液 10μL,按 0、2、4、8、12 h分別進樣分析,測定峰面積值。三種成分的結果分別為:梔子苷 RSD 1.57%、綠原酸 RSD 1.50%、西紅花苷-1 RSD 1.81%。表明梔子苷,綠原酸和西紅花苷-1在 12 h內均穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取同一批梔子藥材 18份,精密稱定,照供試品溶液制備方法制備,分別取 10μL進樣分析,測定梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1含量,梔子苷 RSD為1.85%,綠原酸 RSD為 2.17%,西紅花苷-1 RSD為1.56%,表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的供試品定量,分別精密加入梔子苷、綠原酸及西紅花苷-1對照品溶液適量,按供試品溶液制備方法分別處理,同法測定含量,計算得梔子苷平均回收率為 101.44%,RSD為 1.16 %;綠原酸平均回收率為 99.87%,RSD為 2.77%;西紅花苷-1平均回收率為 101.02%,RSD為 2.01 %。測定結果見表 2。

表 2 加樣回收率試驗結果 (n=5 or 6)Table 2 Results of recovery test(n=5 or 6)

0.2504 0.1066 0.1040 0.2116 100.95西紅花苷-1 Crocin 1 0.0499 0.6198 0.6240 1.2433 99.92 101.02 2.01 0.0503 0.6248 0.6240 1.2676 103.02 0.0501 0.6223 0.6240 1.2672 103.35 0.0500 0.6211 0.6240 1.2573 101.95 0.0508 0.631 0.6240 1.2451 98.42 0.0503 0.6248 0.6240 1.2456 99.49

2.9 樣品測定

取不同顏色梔子果實干燥粉末(過四號篩)各 3份,精密稱定,按 2.3項下方法制備各供試品溶液,分別精密吸取各供試品溶液 10μL進樣,測定結果見圖 4～7。

3 討論

3.1 預實驗時考察了超聲、回流處理對綠原酸和西紅花苷-1提純效果的影響,2種成分 2種提取方法提取率均相當,但超聲提取法操作更簡便,因此采用超聲提取樣品;提取溶劑考察結果顯示 70%甲醇對綠原酸的提取率最高,而 50%甲醇對西紅花苷-1的提取率最高;提取時間考察結果顯示 20 min對綠原酸提取完全,對西紅花苷-1則是 40 min;考察冰浴與室溫對西紅花苷-1的提取效果,結果顯示室溫提取率較高且操作簡便,因此采用室溫提取。

3.2 文中建立的各色譜方法適用于各成分的測定,由圖 1,2,3可以看出供試品中各組分與其他組分均達到基線分離,且基線平穩(wěn)。雖然現(xiàn)有很多文獻[5]采用DAD檢測器同時測定梔子中多種成分,但是每種成分分別在最佳提取及分離條件下測定而得到的含量應該更準確。

3.3 圖 4的結果表明,梔子苷在梔子果實成熟過程中出現(xiàn)兩個含量高峰,一個高峰出現(xiàn)在果實達到最大體積、顏色為青色時;另一個高峰出現(xiàn)在果實完全成熟之前,即顏色為 1/3青 2/3黃時;因而梔子苷的累積規(guī)律表現(xiàn)為“高-低-高-低”的趨勢。付小梅等[3]也認為梔子苷在果實發(fā)育期有兩個高峰。綠原酸在整個梔子果實成熟過程中,也有兩個含量高峰,第一個較小,第二個出現(xiàn)在果實完全成熟之前,與梔子苷的第二個高峰重疊(圖 5)。西紅花苷 -1與梔子苷的累積規(guī)律相似,同樣有兩個含量高峰,第一個高峰與梔子苷的第一個高峰重疊,但第二個高峰出現(xiàn)在果實完全成熟、即果實顏色為全黃色時(圖 6)。同時比較三種活性成分的累積規(guī)律 (圖7),可以看出,綠原酸在三種活性成分中的相對含量最低,梔子苷的相對含量最高。三種成分的累積高峰都比較陡峭。

圖7 不同發(fā)育時期梔子果實中三種有效成分的含量變化Fig.7 Dynamic variation of the content of three active compounds from the fruits ofGardenia jasm inoidesin different ripening stages

本研究是以果實的顏色來劃分梔子果實發(fā)育過程,并同時考察梔子苷、綠原酸和西紅花苷-1等三種活性成分的累積規(guī)律。以顏色劃分果實發(fā)育過程并考察活性成分含量,比考察不同采收期僅梔子苷的含量要更能全面、準確反映活性成分的累積規(guī)律。

詳細研究梔子活性成分在果實發(fā)育過程中的累積規(guī)律,可以為梔子的采收提供更加科學的依據(jù)。藥典僅規(guī)定了梔子苷的含量作為有效成分的指標,因此在全青期和 1/3青 2/3黃期都可以采收。由于西紅花苷的抗氧化作用的發(fā)現(xiàn)[6],該類化合物的藥理作用越來越受到重視。根據(jù)西紅花苷-1的累積規(guī)律,如果需要獲得西紅花苷-1高含量的果實,則應在梔子全青或全黃期采收。

由于三種活性成分的累積高峰都表現(xiàn)得比較陡峭,因而根據(jù)每一個果實的顏色來適時采收,才能獲得最高含量的目標活性成分。

致謝:廣州中醫(yī)藥大學中藥學院 2005級學生林詩東和譚宏韜協(xié)助采集本研究的材料。

圖 8 不同發(fā)育時期的梔子果實Fig.8 Fruits ofGardenia jasm inoidesin different developing stages

1 Ch P(中國藥典).Beijing:Chemistry Industry Press,2005. 173.

2 Xu J(徐娟),Tu BK(涂炳坤),Deng XZ(鄧先珍),et al. Advances on development and utilization of compositions withinGardenia jasm inoides.Hubei Forestry Sci Tech(湖北林業(yè)科技),2005,136:42-43.

3 Fu XM(付小梅),Chu XL(褚小蘭),Fan JS(范佳生),et al.Content analysis on gardenoside in grown and ungrown fruits of gardenia from different habitats.J ChinM edM at(中藥材),2000,23:754.

4 Zhao J(趙靜),You GJ(游國鈞),Li H(李輝).Deter mination of jas minoidin in gardenia at different culling period.Guiding J TCM(中醫(yī)藥導報),2007,13(7):102.

5 HeML,Cheng XW,Chen JK.Simultaneous deter mination of five major biologically active ingredients in different parts ofGardenia jasm inoidesfruits byHPLC withDiode-Array detection.Chrom atographia,2006,64:713.

6 Chen Y,Zhang H,Tian X,et al.Antioxidant potential of crocins and ethanol extracts ofGardenia jasm inoidesELL IS andCrocus sativusL.:A relationship investigation be tween antioxidant activity and crocin contents.Food Chem istry,2008, (109):484-492.

Studies on the Accumulation ofMajor Active Compounds from Gardenia jasm inoidesFruits in D ifferent Ripen ing Stages

HE Guo-zhen1＊,ZHOU Mei1,TANGLi-yun2,MA Li-min1,XU Hong-hua1

1College of Traditional ChineseM edicine,Guangzhou University of ChineseM edicine,Guangzhou 510006,China;2College of L ife Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China

According to the color,the whole ripening stage of gardenia(Gardenia jasm inoidesEllis)fruit can be divided into stages of cyan,2/3 cyan and 1/3 yellow,half of cyan and yellow,1/3 cyan and 2/3 yellow,yellow and scorch.The contents of three major bioactive compounds of geniposide,chlorogenic acid and crocin-1 were determined by HPLC method.The result shows that two accumulation peaks of each bioactive compound appeared during ripening stage.The shapes of all the peakswere sharp.And the stageswhich peaks appeared were not exact the same.The peaks of geniposide appeared at cyan stage and stage of 1/3 cyan and 2/3 yellow,whereas the peaks of crocin-1 appeared at cyan and yellow stages.The best harvesting time should be decided by colorof each fruit,and cyan stage should be the t ime for geniposide and crocin-1.To obtain higher content of target bioactive compound,fruits should be collected in t ime.

geniposide;chlorogenic acid;crocin-1;best harvesting stage;content deter mination

R284.1;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0678-05

2009-06-15 接受日期:2009-09-08

廣東省重大科技專項 (2007A032200001);廣州市科技攻關重大項目(2007Z1-E5035)

＊通訊作者 Tel:86-20-39358553;E-mail:heguozhen@yahoo.com