韓陽(yáng)陽(yáng)，王天曉，朱海芳，王 瑋，王建華,*

苦菜不同部位提取物的抗氧化活性

韓陽(yáng)陽(yáng)1，王天曉2，朱海芳1，王 瑋1，王建華1,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271017；2.廈門大學(xué)材料學(xué)院，福建 廈門 361005)

分別用水、乙醇(體積分?jǐn)?shù)分別為25%、50%、75%)和無(wú)水乙醇，對(duì)苦菜的根、莖、葉、花4個(gè)部位進(jìn)行冷浸提取。測(cè)定不同處理?xiàng)l件下的提取率，并用DPPH自由基清除法檢測(cè)提取物的抗氧化活性；測(cè)定提取物的總黃酮和總多酚類物質(zhì)的含量及其EC50。結(jié)果表明：用50%乙醇提取的苦菜各部位提取率最高，不同部位不同溶劑提取物的抗氧化活性均呈明顯的劑量關(guān)系；提取物的抗氧化活性與其中總黃酮和總多酚的含量有關(guān)；不同部位的抗氧化能力大小為：花＞葉＞莖＞根。

苦菜；總黃酮；總多酚；抗氧化活性

苦菜(Sonchus oleraceus L.)為菊科苦苣屬的一年生或兩年生草本植物，又名苦荬菜、苣荬菜[1]?？嗖撕卸喾N營(yíng)養(yǎng)和功能成分，是一種藥食同源的植物，我國(guó)民間食用苦菜已有2000多年的歷史?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，長(zhǎng)期食用苦菜及其制品可預(yù)防腫瘤、養(yǎng)血保肝、消炎利膽、降壓降脂、增強(qiáng)人體免疫力等[2]，尤其是對(duì)糖尿病、心腦血管病、動(dòng)脈硬化等多種中老年疾病以及由細(xì)菌引起的各種炎癥、失眠、神經(jīng)衰弱等疾病都有很好的預(yù)防和治療作用。盧新華[3]和李美化[4]等的實(shí)驗(yàn)證明，苦菜有明顯的抗氧化作用，但有關(guān)其不同部位的抗氧化活性鮮見報(bào)道。本研究采用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液冷浸提取苦菜不同部位的抗氧化物質(zhì)，用DPPH自由基清除法對(duì)提取物的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，并測(cè)定提取物中的總黃酮和總多酚含量，旨在為為苦菜的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用苦菜于2009年5月采自于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物標(biāo)本園，苦菜種植生長(zhǎng)為粗放型常規(guī)管理。

DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼自由基)、原兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma-Fluka 公司；無(wú)水乙醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、碳酸鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、三氯化鋁等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；BT 25S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；YP2002型電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦菜不同部位抗氧化物質(zhì)的提取

將苦菜各部位(根、莖、葉、花)分開，用自來(lái)水迅速?zèng)_洗干凈并用吸水紙吸干表面水分，超低溫保存?zhèn)溆谩Ｓ秒娮犹炱綔?zhǔn)確稱取20g上述備用的苦菜根樣品，分別加入去離子水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和無(wú)水乙醇各150mL，室溫下冷浸提取24h，倒出提取液，再續(xù)加溶劑150mL，如此反復(fù)提取3次，合并提取液。將所得提取液放入水浴鍋內(nèi)，于60℃濃縮至基本無(wú)液體狀態(tài)，放入干燥箱內(nèi)在60℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，然后加入適量上述對(duì)應(yīng)的乙醇溶液(約15mL)，超聲溶解后，轉(zhuǎn)移至容量瓶?jī)?nèi)，定容至25mL，備用。

苦菜莖、葉、花的材料處理與提取方法與苦菜根相同。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

[5]，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度(A)與兒茶素含量(Y)的關(guān)系曲線的回歸方程：A=5.5615Y+0.00442，R2=0.99910。用此方程式計(jì)算出不同體積分?jǐn)?shù)乙醇處理的苦菜不同部位提取物中總黃酮的含量。

1.3.3 總多酚含量的測(cè)定

Folin-Ciocalteu試劑的制備參考文獻(xiàn)[6]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備參考文獻(xiàn)[7]，稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為0.02mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL于10mL容量瓶中，加入Folin-Ciocalteu試劑1.80mL，混勻，再加入3mL Na2CO3(20g/100mL)，加離子水補(bǔ)足體積至10mL，室溫反應(yīng)2h，于765nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。得到吸光度(A)與沒食子酸含量(Y)的關(guān)系曲線的回歸方程：A=0.21290Y+0.01537，R2=0.9987。

用此方程式計(jì)算出不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液提取的苦菜不同部位提取物中總多酚的含量，以沒食子酸的相對(duì)量表示總多酚的含量。

1.3.4 苦菜不同部位提取物的抗氧化活性測(cè)定

DPPH溶液的配制：用萬(wàn)分之一電子天平準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品0.14712g，用95%乙醇定容至100mL，得質(zhì)量濃度為147.12mg/mL(約3.678×10-3mol/L)的DPPH儲(chǔ)備液，置于冰箱中冷藏備用。

準(zhǔn)確量取適量樣品于試管內(nèi)，加入DPPH溶液0.20mL，用無(wú)水乙醇定容至10mL，室溫反應(yīng)30min，用紫外分光光度計(jì)在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合溶液的吸光度(A1)。同時(shí)準(zhǔn)確量取DPPH溶液0.20mL，用無(wú)水乙醇準(zhǔn)確定容至10mL，室溫反應(yīng)30min，用紫外分光光度計(jì)在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定混合溶液的吸光度(A0)。用下列公式計(jì)算提取液對(duì)DPPH自由基的清除率(%)[8]。

1.3.5 半數(shù)有效濃度(EC50)的計(jì)算

參考文獻(xiàn)[9]，根據(jù)各樣品清除DPPH自由基的曲線，計(jì)算得到DPPH的原始濃度減少一半時(shí)各提取物的添加量(EC50)，根據(jù)EC50的大小判斷不同提取物清除自由基的能力，EC50越小其清除自由基的能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)苦菜各部位的提取率

表1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)苦菜各部位的提取率Table 1 Extraction efficiencies of ethanol soluble substances from different parts of Sonchus oleraceus L. using water and different concentrations of ethanol

由表1可知，在其他條件均相同的前提下，根在用25%乙醇和50%乙醇處理時(shí)提取率最大，為11.7%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，提取物質(zhì)的總量逐漸降低。莖、葉和花的最大提取率均是在用50%乙醇處理時(shí)，分別為5.5%、7.1%和11.8%，用25%乙醇處理時(shí)的提取率與50%乙醇處理時(shí)提取率相差不大。

2.2 苦菜各部位提取物對(duì)DPPH自由基的清除率

2.2.1 苦菜根提取物的DPPH自由基清除率

表2 苦菜根提取物的DPPH自由基清除率Table 2 DPPH free radical scavenging rates of extracts of Sonchus oleraceus L. roots at different concentrations

由表2可知，苦菜根的乙醇溶液提取物各質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基均有一定的清除活性，并且清除率與提取物的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)劑量關(guān)系，其清除率隨提取物質(zhì)量濃度的增大而提高，在質(zhì)量濃度為13.6mg/mL時(shí)，各提取物的清除率均最大。不同質(zhì)量濃度乙醇提取物在相同的提取物質(zhì)量濃度條件下清除率也有很大不同，其中去離子水提取物和25%乙醇提取物的清除活性相差很小，75%乙醇提取物在各質(zhì)量濃度條件下對(duì)DPPH自由基的清除率均大于其他處理的提取物，其次是50%乙醇提取物。

2.2.2 苦菜莖提取物的DPPH自由基清除率

表3 苦菜莖提取物的DPPH自由基清除率Table 3 DPPH free radical scavenging rates of extracts of Sonchus oleraceus L. stems at different concentrations

由表3可知，與苦菜根相同，苦菜莖的各質(zhì)量濃度乙醇溶液提取物對(duì)DPPH自由基均有清除活性，并且呈現(xiàn)劑量關(guān)系。在質(zhì)量濃度為9.6mg/mL時(shí)，各處理的清除率均最大。在相同的提取物質(zhì)量濃度條件下，莖不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物的清除活性也有很大不同?？傮w來(lái)看，在各質(zhì)量濃度條件下，去離子水提取物對(duì)自由基的清除率均最大。

2.2.3 苦菜葉提取物的DPPH自由基清除率

表4 苦菜葉提取物的DPPH自由基清除率Table 4 DPPH free radical scavenging rates of extracts of Sonchus oleraceus L. leaves at different concentrations

由表4可知，苦菜葉的各質(zhì)量濃度乙醇溶液提取物對(duì)DPPH自由基也同樣有清除作用，并且呈現(xiàn)劑量關(guān)系。在質(zhì)量濃度為3.2～4.8mg/mL之間，25%乙醇提取物的清除率最大。75%乙醇提取物的清除率在質(zhì)量濃度為4.0mg/mL達(dá)到最大值后稍有下降，這可能與反應(yīng)生成沉淀有關(guān)。所有處理中，無(wú)水乙醇提取物清除率在各個(gè)質(zhì)量濃度中均為最低。

2.2.4 苦菜花提取物的DPPH自由基清除率

由表5可知，苦菜花的各質(zhì)量濃度乙醇溶液提取物對(duì)DPPH自由基同樣有清除作用，并且呈現(xiàn)劑量關(guān)系。在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各提取物對(duì)自由基清除率的總體變化趨勢(shì)為：75%乙醇＞50%乙醇＞無(wú)水乙醇＞去離子水＞25%乙醇。

表5 苦菜花提取物的DPPH自由基清除率Table 5 DPPH free radical scavenging rates of extracts of Sonchus oleraceus L. flowers at different concentrations

2.3 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)苦菜不同部位總黃酮和總多酚的提取效果及半數(shù)有效濃度的分析

表6 苦菜不同部位提取物中總黃酮、總多酚的含量及EC50Table 6 Contents of total flavonoids and total polyphenols and EC50for scavenging DPPH free radicals of extracts from different parts of Sonchus oleraceus L.

由表6可知，在各乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下，苦菜不同部位間的總黃酮含量大小為：花＞葉＞莖＞根。用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取相同部位，所得總黃酮含量差異較大。在根中，前4個(gè)處理的總黃酮含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高逐漸增大，75%乙醇提取物所得總黃酮含量最高，但用無(wú)水乙醇提取時(shí)總黃酮含量急劇下降。在莖中，總黃酮的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高呈先降低后升高的趨勢(shì)，用無(wú)水乙醇做提取劑時(shí)含量達(dá)到最高，而用25%乙醇提取時(shí)含量最低。在葉中，無(wú)水乙醇提取物中總黃酮含量最高，其次是去離子水提取物時(shí)，二者相差很小。在花中，各提取物中總黃酮含量的變化趨勢(shì)與莖類似。

與總黃酮含量類似，不同部位間總多酚含量也有很大差異，呈現(xiàn)花＞葉＞莖＞根的趨勢(shì)。用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取的總多酚含量差異很大。在根中，用25%乙醇提取的總多酚含量最高，其次是去離子水。在莖中，總多酚含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高逐漸降低，含量最高的是去離子水提取物，最低的是無(wú)水乙醇提取物。在葉中，同樣是去離子水提取的總多酚含量最高，其他處理的總多酚含量依次為50%乙醇提取物＞75%乙醇提取物＞25%乙醇提取物＞無(wú)水乙醇提取物。在花中，總多酚含量最高的是50%乙醇提取物，其次是去離子水和75%乙醇提取物的。

以總黃酮(總多酚)含量為橫坐標(biāo)，EC50為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果表明：苦菜不同部位的EC50大小與其中的總黃酮和總多酚含量有一定的相關(guān)性。其中EC50與總黃酮含量符合一元一次方程模型，其方程分別為：根：Y=－4.5722X＋14.75，R2=0.8985；莖：Y=1.9507X－1.1836，R2=0.6359；葉：Y=0.0841X＋0.8364，R2=0.0352；花：Y=－0.0443X＋1.3397，R2=0.3559。EC50與總多酚含量也符合一元一次方程模型，其方程分別為：根：Y=－0.0056X＋11.719，R2= 0.0507；莖：Y=－0.0207X＋15.112，R2=0.8879；葉：Y=－0.004X＋6.1556，R2=0.6762；花：Y=－0.0014X＋3.0798，R2=0.5171。總體來(lái)說(shuō)，不同部位EC50的大小順序?yàn)椋焊厩o＞葉＞花。

3 結(jié) 論

自由基是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物，對(duì)維持機(jī)體正常新陳代謝起著一定的促進(jìn)作用。正常情況下機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡之中，產(chǎn)生過(guò)多或清除過(guò)慢，均會(huì)給機(jī)體造成不利的影響。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自由基清除物質(zhì)的能力逐漸下降，導(dǎo)致自由基過(guò)剩，加速生命的衰老并導(dǎo)致一系列的疾病，是誘發(fā)腫瘤、心血管疾病等惡性疾病的重要原因。自由基清除物質(zhì)能夠清除機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)多自由基，達(dá)到預(yù)防和消除疾病的作用，從而增進(jìn)機(jī)體的健康。蔬菜作為日常膳食的重要組成部分，對(duì)于維護(hù)機(jī)體自由基動(dòng)態(tài)平衡具有非常積極的意義[10]。從天然食品中尋找和發(fā)現(xiàn)具有較好自由基清除作用的功能因子已成為現(xiàn)代食品研究和開發(fā)的重要內(nèi)容[11-12]。

多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚性羥基的植物成分的總稱，按結(jié)構(gòu)分為酚酸(phenolic acids)、類黃酮(flavonoids) 以及不常見的1,2-二苯乙烯(stilbenes) 和木酚素(lignans)。它存在于一些常見的植物性食物中[13]。黃酮類化合物廣泛存在于植物界，是一類有強(qiáng)抗氧化活性的植物次生代謝多酚，是許多中草藥的有效成分，有廣泛的藥理作用[14]。在自然界中最常見的是黃酮和黃酮醇。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇冷浸提取苦菜各部位，獲得的提取物總量有差異，總體來(lái)看，以50%乙醇體積分?jǐn)?shù)獲得的提取物最多(表1)。檢測(cè)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物的抗氧化活性時(shí)，在提取物質(zhì)量濃度相同的條件下，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的提取物的抗氧化效果不同。用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇浸提苦菜各部位，提取液中總黃酮和總多酚含量不同，提取液中多酚類物質(zhì)的含量顯著高于黃酮類(表6)。

線性回歸分析結(jié)果表明：提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力與其中總黃酮和總多酚類物質(zhì)的含量有一定相關(guān)關(guān)系，但根中的總多酚含量與EC50相關(guān)性不大，這可能是由于除總多酚外，根提取液中還有其他有效成分對(duì)DPPH自由基起清除起作用[15]。除此之外，苦菜的根、莖、葉、花各部位對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力，其中花提取物的清除能力最強(qiáng)，其次是葉，根的清除能力最弱。

本實(shí)驗(yàn)主要測(cè)定了苦菜不同部位的抗氧化能力大小及其中黃酮類和多酚類物質(zhì)與其抗氧化能力之間的關(guān)系，植物中的抗氧化物質(zhì)不僅包括以上兩種，還有維生素類、生物堿類、皂苷類等物質(zhì)[16]，它們與苦菜抗氧化能力之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

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Antioxidant Activity Assessment of Extracts from Different Parts of Sonchus oleraceus L.

HAN Yang-yang1，WANG Tian-xiao2，ZHU Hai-fang1，WANG Wei1，WANG Jian-hua1,*
(1. College of Life Science, Shandong Agricultural University, Tai， an 271017, China；2. College of Materials, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Four different parts of Sonchus oleraceus L. (root, stem, leaf and flower) were extracted separately with water and different concentrations of ethanol (25%, 50%, 75% and 100%) under room temperature. The calculation of extraction efficiency was performed, and the resultant extracts were tested for their DPPH radical scavenging capacity (EC50, half maximal effective concentration) and the contents of total flavonoids. Fifty percent ethanol gave the highest extraction efficiency of ethanol soluble substances from each of these four parts of Sonchus oleraceus L. Different extracts from different parts of Sonchus oleraceus L. all had significantly dosage-dependent antioxidant activity, which was related to the contents of total flavonoids and total polyphenols. The order of antioxidant activity for these four parts was: flower ＞ leaf ＞ stem ＞ root.

Sonchus oleraceus L.；total flavonoids；total polyphenols；antioxidant activity

Q949.95

A

1002-6630(2010)19-0045-04

2009-12-20

泰安市2007中藥現(xiàn)代化科技專項(xiàng)(5012100999)

韓陽(yáng)陽(yáng)(1987—)，女，碩士研究生，主要從事植物學(xué)研究。E-mail：hanyy2009@163.com

*通信作者：王建華(1963—)，男，教授，博士，主要從事植物資源研究與開發(fā)。E-mail：jiwangjh@163.com