張虹雨，范曉娜，黃 敏，曹 毅，鄭永唐

(1.中國科學院動物模型與人類疾病機理重點實驗室，昆明 650223;2.中國科學院研究生院，北京 100049;3.昆明市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，昆明 650011)

獼猴結(jié)腸鏡下活檢組織病理學觀察

張虹雨*1，2，3，范曉娜*1，黃 敏3，曹 毅1，鄭永唐1

(1.中國科學院動物模型與人類疾病機理重點實驗室，昆明 650223;2.中國科學院研究生院，北京 100049;3.昆明市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，昆明 650011)

目的 通過對獼猴結(jié)腸鏡檢及活檢取材，對結(jié)腸鏡檢測方法應用于非人靈長類動物予以評價。方法實驗猴在麻醉狀態(tài)下接受結(jié)腸鏡檢查和活檢標本取材，對活檢標本進行固定和病理切片觀察，并對所檢猴進行解剖和組織學觀察，比較各取材點的情況。結(jié)果 結(jié)腸鏡下及大體標本觀察見獼猴腸壁厚度明顯小于人體，活檢取材部位見黏膜破損、腸出血，個別部位見腸穿孔。病理切片HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，與人體比較，獼猴大腸腺較小而表淺，固有層內(nèi)淋巴小結(jié)數(shù)量較少，肌層、黏膜下層明顯較薄。結(jié)論 對獼猴行結(jié)腸鏡檢查及鏡下活檢取材是可行的，但因獼猴腸壁較人體薄而極易穿孔，故需盡量應用活檢杯小的活檢鉗，并需要充分的腸道準備和有經(jīng)驗的腸鏡操作。

獼猴;結(jié)腸鏡;黏膜活檢

獼猴是生理結(jié)構最接近人體的實驗動物之一，對建立適合多種疾病研究的非人靈長類動物模型具有重要價值。胃腸道不僅是消化器官，胃腸黏膜具有的屏障功能和免疫特性參與很多重要疾病的病理改變和免疫反應過程。獼猴內(nèi)鏡檢查及鏡下活檢已成為研究消化道疾病和免疫性疾病如AIDS的重要方法［1，2］。本實驗采用結(jié)腸鏡技術對獼猴結(jié)腸黏膜進行鏡下觀察、活檢標本取材和切片觀察，對結(jié)腸鏡檢測技術應用于非人靈長類動物消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)研究進行初步探索。

1 材料和方法

1.1 受試動物

雄性獼猴2只，體重及年齡分別為:1號12.6 kg、13歲;2號13.5 kg、20歲。由中國科學院昆明動物研究所實驗動物中心提供［SCXK(滇)2008-0001］。

1.2 麻醉藥物

復方氯胺酮(100 mg/支)、3%苯巴比妥。

1.3 腸黏膜取材相關器材

動物實驗手術臺;膜式電動吸引器(天津市醫(yī)療器械二廠);CF-40L型纖維結(jié)腸鏡(日本OLYMPUS公司);FB-210U一次性活檢鉗(腸鏡)(日本 OLYMPUS公司);KA2411S一次性活檢鉗(十二指腸鏡)(日本PENTAX公司);靜脈輸液器。

1.4 內(nèi)鏡檢查和活檢取材

術前對手術室進行紫外照射消毒3 h，對手術臺用75%酒精進行擦拭，對結(jié)腸鏡及其配件按照內(nèi)鏡常規(guī)消毒程序進行消毒。術前動物禁食24 h，因動物拒絕食用腸道準備用藥(硫酸鎂溶入動物食物及水中)，故未行腸道準備。用復方氯胺酮(生理鹽水5∶1稀釋，0.1mL/kg)肌肉注射麻醉，待動物肌肉松弛，呼吸平穩(wěn)，睫毛反射消失后，將動物固定于檢測臺上。以生理鹽水配制的3%苯巴比妥對昏睡中的獼猴后肢靜脈點滴注射，在術中鞏固麻醉效果。內(nèi)鏡前端用石蠟油潤滑，內(nèi)鏡經(jīng)肛門依次進入直腸、乙狀結(jié)腸、降結(jié)腸，檢查過程中利用與腸鏡相連的膜式電動吸引器，先注生理鹽水后吸引，將腸腔內(nèi)殘余糞便清理干凈。由于未行腸道準備，動物腸腔內(nèi)有較多糞便，雖應用內(nèi)鏡注水、吸引器抽吸，仍殘留較多干大便，故腸鏡檢查僅能到達降結(jié)腸。內(nèi)鏡下注氣使腸腔充盈以充分暴露腸壁，注意觀察各段腸腔及黏膜狀況，并在結(jié)腸各段取黏膜活檢。在結(jié)腸鏡下對1號獼猴用 FB-210U一次性活檢鉗(腸鏡)，對2號獼猴用KA2411S一次性活檢鉗(十二指腸鏡)分次夾取腸黏膜取材，將腸黏膜標本用濾紙粘取后放入包埋框中，福爾馬林固定。對1號獼猴，手術結(jié)束后停止靜脈注射麻醉藥，等待其自然蘇醒后將其抬回籠中，觀察其飲食和身體狀況。1號獼猴于術后第3天死亡，對尸體行病理解剖發(fā)現(xiàn)有結(jié)腸穿孔和腹腔感染，行全身取材，隨后行大體觀察及顯微鏡觀察。對2號獼猴，手術結(jié)束后繼續(xù)靜脈注射麻醉藥使獼猴達到深度麻醉直至死亡，對尸體行病理解剖、全身取材，隨后行大體觀察及顯微鏡觀察。

2 結(jié)果(圖1～2見彩插8)

2.1 結(jié)腸鏡下觀察

所見大腸腸壁菲薄，黏膜表面平坦，無絨毛，色澤淡紅，黏膜下血管清晰可見;直腸、乙狀結(jié)腸、降結(jié)腸各段未見明顯半月形皺襞，如直腸Houston瓣。

2.2 大體標本觀察

所取腸段可見結(jié)腸帶及結(jié)腸袋等結(jié)構與人體相似，但腸壁厚度明顯小于人體腸壁，降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸腸壁厚度平均為1.25±0.16mm。2只獼猴大腸腸壁活檢取材點中，多數(shù)取材點充血水腫，僅累及黏膜層者無出血，累及黏膜下層及肌層者因有豐富的血管分布而發(fā)生出血。1號獼猴個別取材部位不僅明顯出血，且因累及漿膜層而穿孔(圖1)。

2.3 病理切片HE染色觀察

獼猴大腸腸壁解剖層次與人體基本相同，即由內(nèi)到外分別為:黏膜層(單層柱狀上皮、固有層、黏膜肌層)、黏膜下層(結(jié)締組織)、肌層(內(nèi)環(huán)、外縱)、漿膜層。獼猴大腸腸壁病理切片HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，與人體比較，獼猴大腸腺較小而位置表淺，固有層內(nèi)淋巴小結(jié)數(shù)量較少，肌層、黏膜下層明顯較薄，而單層柱狀上皮、黏膜肌層、漿膜層無明顯差異?；顧z取材部位充血水腫，黏膜缺損多深達黏膜下層，部分伴有出血。1號獼猴的個別取材部位有穿孔，累及漿膜層(圖2)。

3 討論

3.1 動物腸道準備

人體腸鏡檢查前，予患者服用瀉藥(如硫酸鎂、聚乙二醇、甘露醇、番瀉葉等)以排盡糞便，腸腔清潔便于內(nèi)鏡觀察和手術，稱為腸道準備，此過程需要隨藥物服用大量的水。本實驗未能對獼猴成功實施腸道準備，因為:(1)猴飲水很少，主要從水果中攝取身體所需水分，實驗者曾嘗試把瀉藥(硫酸鎂)混入水及食物中讓獼猴服下，但其并不配合。原因可能是獼猴憑其嗅覺和味覺發(fā)現(xiàn)食物及水中混有異物，故拒絕食用;(2)實驗者曾設想將獼猴在麻醉狀態(tài)下從口腔送入瀉藥以進行腸道準備，但此操作很容易引起動物誤吸而致窒息死亡。因此本實驗在腸鏡操作過程中，一邊向腸腔注水，一邊利用電動吸引器吸引稀釋后的糞便，從而達到部分的腸道清潔。

3.2 結(jié)腸鏡檢查及鏡下活檢取材

成年人大腸全長約1.5 m，腸壁厚度一般小于3mm;成年獼猴大腸長約 96～100cm［3］，目前尚無關于猴大腸腸壁厚度的研究報道。我們觀測到，成年獼猴大腸腸壁厚度約為1.25±0.16mm，明顯小于正常成人腸壁。人體大腸的表面有三條與大腸縱軸平行的結(jié)腸帶，由腸壁肌增厚形成。由于結(jié)腸帶短于腸管，使腸管皺縮，形成由橫溝隔開的囊狀外突，稱結(jié)腸袋。結(jié)腸帶之間形成半月形皺襞，此部位相對周圍腸壁較厚。為避免腸黏膜取材時挖取過深而導致穿孔，應選取半月形皺襞進行活檢取材。在本實驗中應用內(nèi)鏡依次觀察獼猴直腸、乙狀結(jié)腸、降結(jié)腸各段腸腔及黏膜，我們發(fā)現(xiàn)兩個值得注意的現(xiàn)象:(1)與人體比較，獼猴大腸腸壁明顯菲薄。(2)鏡下所見獼猴腸壁不具有半月形皺襞或者不明顯，這直接導致活檢取材時無法確定其腸壁的不同厚薄分布。上述特點明顯增加腸黏膜活檢取材的并發(fā)癥發(fā)生率，即腸出血和腸穿孔。因無專門針對動物的內(nèi)鏡活檢鉗，我們對1號獼猴采用腸鏡專用活檢鉗實施腸鏡下活檢取材手術，結(jié)果獼猴死亡，解剖發(fā)現(xiàn)其死于腸穿孔。考慮到腸鏡專用活檢鉗的活檢杯口對獼猴腸壁來說較大，故我們對2號獼猴采用活檢杯口最小的十二指腸鏡專用活檢鉗實施手術，術后解剖未發(fā)現(xiàn)腸壁穿孔。這說明對獼猴行大腸黏膜活檢取材時，應盡量選用活檢杯口小的活檢鉗，以降低腸穿孔的發(fā)生率。

3.3 術后解剖觀察

人體與獼猴腸壁的解剖層次基本相同，即由內(nèi)到外分別為:黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層。獼猴大腸腸壁活檢取材點中，多數(shù)取材點充血水腫，僅累及黏膜層者無出血，累及黏膜下層及肌層者因有豐富的血管分布而發(fā)生出血;個別取材部位不僅明顯出血，而且因累及漿膜層而造成穿孔。活檢取材導致穿孔的原因可能是(1)人體降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸腸壁厚度平均為2.36±0.19mm［4］，而猴腸壁較人更為菲薄，我們測量本實驗中的2只獼猴降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸腸壁厚度平均為1.25±0.16mm，故應用腸鏡活檢鉗取材易穿孔，需盡量采用活檢杯小的十二指腸鏡活檢鉗;(2)鏡下應選取腸壁半月形皺襞進行活檢取材，但本實驗鏡下所見獼猴腸壁不具有半月形皺襞或者不明顯。獼猴大腸大體標本觀察可見結(jié)腸帶及結(jié)腸袋等結(jié)構，為何鏡下半月形皺襞結(jié)構不明顯，可能與腸鏡充氣使腸壁充盈有關，但仍無法完全解釋此現(xiàn)象，有待進一步研究。

3.4 結(jié)腸鏡應用于獼猴活體消化道檢查和活檢取材的前景

國內(nèi)已有關于胃鏡檢查非人靈長類動物上消化道的實驗研究，主要應用于觀察、比較動物感染SHIV 前后胃及十二指腸黏膜的病理變化［5，6］，目前國內(nèi)尚無應用結(jié)腸鏡檢查獼猴并行活檢取材的實驗報道。成人胃壁厚度一般小于5mm，最?；顧z取材的胃竇區(qū)平均為3.58±0.25mm［7］。在臨床及實驗研究中應用胃鏡活檢技術很少發(fā)生穿孔，而腸鏡活檢發(fā)生腸穿孔的風險要大得多，甚至腸鏡檢查本身也可能引起腸穿孔，其主要原因即為腸壁厚度小于胃壁。人體腸鏡活檢取材技術常用于大腸癌、大腸息肉等病變的病理診斷。胃腸黏膜具有的屏障功能和免疫特性與許多重要疾病如胃腸惡性腫瘤、AIDS等的病理改變和免疫反應過程密切相關。所以觀測獼猴的胃腸黏膜變化對研究消化系統(tǒng)疾病或其它疾病的消化道病變有重要價值。目前國內(nèi)外應用獼猴已成功建立了AIDS等多種動物模型［1］，建立成功的獼猴消化內(nèi)窺鏡檢測技術對這些疾病的研究具有現(xiàn)實意義。本實驗應用結(jié)腸鏡技術對獼猴結(jié)腸黏膜進行鏡下觀察、活檢標本取材和切片觀察，對今后利用此技術對非人靈長類動物模型的消化道病變進行活體動態(tài)觀察和檢測積累了重要的經(jīng)驗。

致謝:作者感謝中科院昆明動物所免疫藥理實驗室提供一只實驗獼猴。

［1］Brenchley JM，Schacker TW，Ruff LE，et al.CD4+T cell depletion during all stages of HIV disease occurs predominantly in the gastrointestinal tract［J］.J Exp Med，2004，200(6):749－759.

［2］Mehandru S，Poles MA，Tenner－Racz K，et al.Primary HIV－1 infection is associated with preferential depletion of CD4+T lymphocytes from effector sites in the gastrointestinal tract［J］.J Exp Med，2004，200(6):761－770.

［3］葉智彰，彭燕章，張耀平.獼猴解剖［M］.北京:科學出版社，1985:148.

［4］王錫明，武樂斌，李振家，等.多層螺旋CT在大腸分區(qū)及腸壁厚度測量中的價值［J］.醫(yī)學影像學雜志，2005，15(2):144－146.

［5］代小偉，朱華，劉穎，等.非人靈長類動物胃鏡檢測技術的建立［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2008，18(9):75－77.

［6］劉穎，朱華，代小偉，等.SHIV感染恒河猴十二指腸黏膜活檢組織病理學觀察［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2009，19(3):28－31.

［7］王錫明，武樂斌，李振家，等.螺旋CT在胃分區(qū)及胃壁厚度測量中的價值［J］. 醫(yī)學影像學雜志，2001，11(5):290－292.

Pathological Observation of Colonic Biopsy Sample on Rhesus Macaques

ZHANG Hong-yu*1，2，3，F(xiàn)AN Xiao-na*1，HUANG Min3，CAO Yi1，ZHENG Yong-tang1
(1.Key Laboratory of Animal Models and Human Diseases Mechanisms，Kunming Institute of Zoology，the Chinese Academy of Sciences，Kunming 650223，China;2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China;3.Gastroenterology Department，The First People’s Hospital of Kunming，Kunming 650011，China)

Objective To evaluate the significance of coloscopy on Rhesus macaques'alimentary tract by using coloscopy and mucosa biopsy.Method Monkeys underwent coloscopy at the state of anesthesia.Thereafter post-mortem examination was carried out on the monkeys.The colonic biopsy and autopsy specimens were fixed，stained with hematoxylin and eosin，and observed pathologically.Results Punctate hemorrhages and perforations were observed in the biopsy sites.Compared with human colon，the wall of monkeys'colon was thinner，especially submucosa and muscular layer.The crypts of Lieberkuhn in the colon mucosa were smaller and more superficial，and there were less folliculus lymphaticus in the lamina propria.Conclusion It is feasible to apply coloscopy and mucosa biopsy on Rhesus macaque.Because Rhesus macaque's colon is thin and easy to perforate，a suitable biopsy forceps，sufficient bowel preparation and experienced operation are essential for a success of coloscopy and mucosa biopsy.

Rhesus macaque;Coloscopy;Mucosa biopsy

R332

B

1671-7856(2010)06-0066-03

2010-01-20

圖1 獼猴結(jié)腸黏膜大體標本
Fig.1 Specimen of Rhesus Macaque's colonic mucosa
注：A：活檢取材點出血；B：活檢取材點穿孔
Note: A: haemorrhage in the biopsy site; B: perforation in the biopsy site

圖2 獼猴結(jié)腸黏膜病理表現(xiàn)
Fig.2 Pathological appearance of Rhesus Macaque's colonic mucosa
注：A：正常結(jié)腸黏膜(HE×5)；B：黏膜層出血(HE×20)；C：活檢取材點出血(HE×l0)；D：活檢取材點穿孔(HE×l0)
Note: A: normal colonic mucosa(HE×5); B: haemorrhage in mucous layer(HE×20);C: haemorrhage in the biopsy site(HE×l0); D: perforation in the biopsy site(HE×l0)

張虹雨，男，博士生，研究方向:黏膜免疫病理。范曉娜，女，助理研究員，研究方向:分子病理學。

*:共同第一作者。

曹毅，研究員，博士生導師。E-mail:caoy@mail.kiz.ac.cn