劉靖清，張 亮，袁 濤

（1.鹽城市畜牧獸醫(yī)局，江蘇鹽城 224002；2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046）

豬弓形蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查與分析

劉靖清1，張 亮2，袁 濤2

（1.鹽城市畜牧獸醫(yī)局，江蘇鹽城 224002；2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046）

弓形蟲病是龔第弓形蟲引起的一種人和多種動(dòng)物共患寄生蟲病。豬肉被認(rèn)為是引起人感染弓形蟲病的主要傳染源，鑒于弓形蟲病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失以及先天性弓形蟲病對(duì)優(yōu)生優(yōu)育的重要影響和獲得性弓形蟲病對(duì)免疫功能低下病人的嚴(yán)重危害。應(yīng)將該病的診、治、防工作作為研究重點(diǎn)。

弓形蟲這一病原體于1908年由Nicolle和Manceaux在北非突尼斯的嚙齒類梳趾鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并正式命名。幾乎同時(shí)，Splendole亦于1908年在巴西一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的家兔體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了弓形蟲。自此以后，陸續(xù)在世界各地的人和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)弓形蟲病。我國(guó)于20世紀(jì)50年代首先在福建的貓、兔等動(dòng)物體發(fā)現(xiàn)了本病病原體，但直至1977年后才陸續(xù)在上海、北京等地發(fā)現(xiàn)過(guò)去所謂的“無(wú)名高熱”是由弓形蟲引起的，并引起普遍的重視。弓形蟲病宿主種類十分廣泛，和動(dòng)物感染率都很高。據(jù)國(guó)外報(bào)道，人群的平均感染率25%～50%，有人推算全世約1/4的人感染弓形蟲。在免疫缺陷和免疫抑制病人合并感染弓形蟲可導(dǎo)致腦炎發(fā)生。豬暴發(fā)弓形蟲病時(shí)，可使整個(gè)豬場(chǎng)發(fā)病，死亡率高達(dá)60%以上。其它家畜如牛、羊、馬、犬和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等也都能感染弓形蟲。因此本病給人類健康和畜牧發(fā)展帶來(lái)很大危害和威脅。目前各省市各種動(dòng)物均有本病的存在。其特征表現(xiàn)為高熱稽留，呼吸困難，皮膚發(fā)紺，流產(chǎn)，便秘或腹瀉。臨床可見急性、亞急性和慢性三種病型，嚴(yán)重的可引起死亡。是目前危害養(yǎng)殖業(yè)的一種重要的寄生蟲性疾病，磺胺類藥物對(duì)弓形蟲有很好的療效，臨床上常用的磺胺六甲氧嘧啶、磺胺五甲氧嘧啶、復(fù)合磺胺嘧啶鈉、強(qiáng)化長(zhǎng)效抗菌劑、甲氧芐胺嘧啶（TMP）和磺胺甲氧吡嗪（SMP2）等都是很好的治療藥物。用藥時(shí)要注意“用早藥、療程足”的治療方針，病情控制后應(yīng)繼續(xù)治療1～2 d，效果較好。

一、材料和方法

（一）材料

1.抗原。弓形蟲間接血凝實(shí)驗(yàn)凍干抗原，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)為20070718。用于檢測(cè)人和動(dòng)物血清或?yàn)V紙干血滴中的弓形蟲抗體，效價(jià)不低于1∶1024。用前按標(biāo)定毫升數(shù)用滅菌蒸餾水稀釋搖勻，1 500～2 000 r/min離心5～10 min，棄去上清液，加等量稀釋液（PDS與兔血清）搖勻，置4℃左右24 h后使用。稀釋后作為診斷液，4℃左右保存，10 d內(nèi)效價(jià)不變。

2.標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和陰性血清。弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（效價(jià)不低于1∶1024），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)為20070718。弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)為20070718。

3.被檢血清。采自甘肅省11地區(qū)的定點(diǎn)屠宰場(chǎng)、養(yǎng)殖場(chǎng)、散養(yǎng)戶等動(dòng)物的血清534份。成年豬從耳靜脈采血，每頭動(dòng)物采血3～5 ml。37℃靜置0.5～1 h后（或2 000 r/min離心5 min）分離血清約1.5 m1，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

4.稀釋液。稀釋液，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)為20070718。

自配稀釋液。先配制含0.1%迭氮鈉的pH7.2, 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS），稱取磷酸氫二鈉19.34 g、磷酸二氫鉀2.86 g、氯化鈉4.25 g、迭氮鈉1.00 g，雙蒸餾水或無(wú)離子水溶解并加至1 000 ml，過(guò)濾后分裝，10磅15 min高壓滅菌。取含0.1%迭氮鈉的PBS 98 ml、56℃滅活30 min的健康兔血清2 ml，混合，無(wú)菌分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.病豬與病料。武威市某豬場(chǎng)飼養(yǎng)發(fā)病豬群；無(wú)菌采取病死豬肺門淋巴結(jié)、肺、肝、脾等臟器組織。

6.主要試劑。

（1）瑞氏染液。市售的瑞氏染色粉0.2 g，加無(wú)水中性甲醇100 ml，溶解后移入棕色小口試劑瓶中，加塞，置室溫下，每日搖動(dòng)45 min，一周后可用。

（2）姬氏染液。取市售姬氏染色粉0.5 g，中性純甘油25.0 ml，無(wú)水中性甲醇25.0 ml。先將姬氏染色粉置研缽中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，直到甘油全部加完為止，將其倒入100 ml的小口試劑瓶中，在研缽中加少量的甲醇以沖洗甘油染液，沖洗液仍傾入上述瓶中，再加再洗再傾入，直到25 ml甲醇全部用完為止。塞緊瓶塞，充分搖勻，而后將瓶置于65℃溫箱中24 h或室溫3～5 d，并不斷搖動(dòng)，即為原液。取原液2.0 ml，加到中性蒸餾水100 ml中，即為染液。

（3）血瓊脂培養(yǎng)基。將滅菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱融化，冷至45℃～50℃，加入無(wú)菌鮮血達(dá)5%（即每100 ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入鮮血5～6 ml），分裝于試管中，擺成斜面，或傾注于平皿，待凝固后，置37℃培養(yǎng)1～2 d，有污染者廢棄，無(wú)菌者保存于冰箱備用。

（4）無(wú)菌鮮血。無(wú)菌手術(shù)法采取健康動(dòng)物（通常是綿羊或家兔）血液，加入盛有無(wú)菌5%檸檬酸鈉溶液的容器中（血與5%檸檬酸鈉的比例約為9∶1），混勻，置冰箱中保存。

（5）青霉素、鏈霉素。購(gòu)自華北制藥廠。

7.主要儀器。微量移液器（25μ l,75 μ l, 1 000 μ l），微量血凝反應(yīng)板（96孔），隔水式恒溫培養(yǎng)箱，溫度范圍5℃～60℃，離心機(jī)4 000 r/min，超生波清洗器，微量攪拌器。

（二）方法

1.弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查。采用弓形蟲病間接血凝試驗(yàn)，對(duì)采自甘肅省11個(gè)地區(qū)的豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。取V型微量反應(yīng)板，按以下步驟操作。

⑴加稀釋液。用移液器將稀釋液加入96孔V型反應(yīng)板上，每孔0.075 ml。定性檢查時(shí)，每個(gè)樣品加4孔，定量則加8孔。每塊板上均應(yīng)設(shè)陽(yáng)、陰性血清對(duì)照，對(duì)照均加8孔。

⑵加待檢血清和陰、陽(yáng)性對(duì)照血清，并作梯度稀釋。第一孔加相應(yīng)血清0.025 ml，混勻后取0.025 ml加入第二孔中，混勻后取0.025 ml加入第三孔中，以此類推。定性檢查時(shí)稀釋至第3孔后，取0.025 ml棄去，第4孔為稀釋液對(duì)照；定量檢查與對(duì)照均稀釋至第7孔后，取0.025 ml棄去，第8孔為稀釋液對(duì)照。

⑶加診斷液。每孔加診斷液0.025 ml，加完后將反應(yīng)板置微型振蕩器上震蕩1～2 min，直到診斷液中的血球分布均勻。取下反應(yīng)板，蓋上一塊玻璃板或干凈紙，以防落入灰塵，置22～37℃，2～3 h后觀察結(jié)果。

表1 甘肅省各地區(qū)豬弓形蟲感染情況

表2 不同月齡豬弓形蟲感染情況

表3 不同地區(qū)豬抗體滴度分布

⑷結(jié)果判定。陽(yáng)性對(duì)照血清滴度不低于1∶1024（第5孔），陰性對(duì)照血清除第1孔允許存在前滯現(xiàn)象（＋），其余各孔均為（-），稀釋液對(duì)照為（-）。依據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)被檢血清進(jìn)行判定。(++++）：100%紅細(xì)胞在孔底呈均質(zhì)的膜樣凝集，邊緣整齊、致密（因動(dòng)力關(guān)系，膜樣凝集的紅細(xì)胞有的出現(xiàn)下滑現(xiàn)象）；（+++）：75%紅細(xì)胞在孔底呈膜樣凝集，不凝集的紅細(xì)胞在孔底中央集中成很小的圓點(diǎn)；(++）：50%的紅細(xì)胞在孔底呈稀疏的凝集，不凝集的紅細(xì)胞在孔底中央集中成較大的圓點(diǎn)；(+）：25%的紅細(xì)胞在孔底凝集，其余不凝集的紅細(xì)胞在孔底中央集中成大的圓點(diǎn)；(-）：所有的紅細(xì)胞均不凝集，并集中于孔底中央呈規(guī)則的最大的圓點(diǎn)。以被檢血清抗體滴度達(dá)到或超過(guò)1:64判為陽(yáng)性，判(++）為陽(yáng)性終點(diǎn)。

二、結(jié)果

（一）豬弓形蟲感染情況通過(guò)間接血凝試驗(yàn)調(diào)查了534頭家畜血清抗體陽(yáng)性55頭（個(gè)），平均陽(yáng)性率為10.29%.

（二）不同地區(qū)豬弓形蟲感染情況通過(guò)間接血凝試驗(yàn)調(diào)查了11個(gè)地區(qū)的534頭豬弓形蟲感染情況，結(jié)果見表1。其中，血清抗體陽(yáng)性55頭，平均陽(yáng)性率為10.29%。

（三）不同月齡的豬感染情況通過(guò)間接血凝試驗(yàn)分別對(duì)武威地區(qū)6～13個(gè)月齡豬弓形蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果見表2。其中，抗體陽(yáng)性37頭，平均陽(yáng)性率11.07%。

（四）抗體滴度分布弓形蟲血清抗體陽(yáng)性的家畜中，豬抗體滴度最高達(dá)1∶1024。在55份陽(yáng)性血清中，1∶64的有35份，占63.63%，1∶ 256的有16份，占29.09%，1∶1024有4份，占7.27%不同地區(qū)豬的抗體滴度分布情況見表3。

三、結(jié)論

1．調(diào)查表明，各地豬均有弓形蟲感染，平均陽(yáng)性率為10.29%

2．調(diào)查的55份陽(yáng)性血清中，1∶256有 16份， 占 29.09%，1∶1024有4份，占7.27%，所以屬急性感染者20份，占36.36%。

3.從豬弓形蟲陽(yáng)性檢出率為10.29%來(lái)看，目前豬弓形蟲病還比較嚴(yán)重，同時(shí)，確診武威地區(qū)某養(yǎng)豬場(chǎng)育肥豬患有弓形蟲病。

4.農(nóng)戶散養(yǎng)、個(gè)體飼養(yǎng)場(chǎng)以及小規(guī)模飼養(yǎng)場(chǎng)的豬弓形蟲陽(yáng)性率明顯高于大規(guī)模飼養(yǎng)場(chǎng)，這主要與衛(wèi)生條件、飼養(yǎng)水平、管理方式有關(guān)。不同月齡豬的弓形蟲感染率沒有明顯的差異，也沒有嚴(yán)格的季節(jié)性，但秋冬季和早春發(fā)病率高，可能與此時(shí)動(dòng)物機(jī)體抵抗力較低有關(guān)。養(yǎng)豬場(chǎng)除了要做好滅鼠、驅(qū)貓工作外，還應(yīng)防范飼料污染，特別是從農(nóng)戶收購(gòu)飼料原料的場(chǎng)，要了解原料與貓的接觸情況，以防止通過(guò)污染飼料渠道感染弓形蟲。

（略）