朱軍莉，王 曄，勵建榮

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江杭州310035)

生物保鮮乳酸菌的篩選及其細(xì)菌素特性研究

朱軍莉，王 曄，勵建榮

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江杭州310035)

利用牛津杯法從傳統(tǒng)泡菜和臘腸中分離的80株乳酸菌中篩選出10株具有較高抑菌活性的乳酸菌。通過排除酸性產(chǎn)物有機酸、過氧化氫干擾及抑菌譜試驗，LAB5和LAB55仍表現(xiàn)廣譜的抑菌活性；2菌株發(fā)酵上清液經(jīng)蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶處理后抑菌活性均有降低，其中LAB5對木瓜蛋白酶敏感，因此可以初步判定這2株乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。2種細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性，pH值越低抑菌能力越強；2株菌表現(xiàn)良好的產(chǎn)酸能力，經(jīng)生理生化和16S rDNA鑒定為植物乳桿菌。

乳酸菌；細(xì)菌素；抑菌能力

隨著食品化學(xué)防腐劑的高殘留和對人體健康的潛在影響，具有無毒、安全等特點的生物保鮮劑日益受到人們的關(guān)注。生物保鮮物質(zhì)直接來源于生物體自身組成成分或其代謝產(chǎn)物，能有效抑制蛋白酶的活性，防止蛋白質(zhì)變性，具有良好的抑菌作用，從而可以達(dá)到保鮮的目的。目前，生物保鮮劑的種類繁多，但是實際應(yīng)用于生產(chǎn)的并不多。

乳酸菌細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中由核糖體合成的蛋白類抑菌物質(zhì)，不僅可以改善腸道生態(tài)，而且是一類具有潛在開發(fā)能力的天然食品防腐劑和飼料添加劑。其中，乳酸鏈球菌所產(chǎn)細(xì)菌素Nisin已被60多個國家廣泛應(yīng)用于乳制品和罐頭制品等保藏。近年來，已有較多產(chǎn)抑菌物質(zhì)的乳酸菌的報道[1-4]，篩選廣譜、高效的乳酸菌素產(chǎn)生菌及細(xì)菌素性質(zhì)研究仍是研究熱點[5-6]。本研究從泡菜和臘腸中篩選出具有生物保鮮價值的乳酸菌并進(jìn)行鑒定，研究了乳酸菌的細(xì)菌素在不同條件下的抑菌效果，為其在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基：液體MRS培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯，2%水瓊脂，1%營養(yǎng)瓊脂。

試劑：過氧化氫酶、蛋白酶K購于上海生物工程公司；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶購于諾維信有限公司，乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品購于Sigma-Aldrich公司；16S rDNA的PCR擴增引物合成和測序列于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他試劑均為分析純：購自華東醫(yī)藥股份有限公司。

儀器：Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機，Aglient 1100高效液相色譜儀，恒溫培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，水平電泳裝置，凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 細(xì)菌的活化

取1mL乳酸菌菌種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ甘揪冱S微球菌、檸檬色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌在營養(yǎng)瓊脂上劃線，熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌，37℃培養(yǎng)12h，挑取單菌落到液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12h，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌效果分析方法

采用雙層瓊脂牛津杯法。將2%水瓊脂倒在固體平板上，待冷卻凝固后，向瓊脂內(nèi)倒入含5%指示菌營養(yǎng)瓊脂，搖勻。待凝固后放入牛津杯，用移液槍向牛津杯內(nèi)加入200μL乳酸菌代謝產(chǎn)物的上清液，37℃培養(yǎng)24h后觀察有無抑菌圈形成，并測量其抑菌直徑。

1.4 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的復(fù)篩

初篩所得的菌株發(fā)酵上清液中加入過氧化氫酶，使最終濃度為0.5mg/mL，37℃水浴2h后檢驗抑菌活性，以排除過氧化氫的干擾。同時以pH值為4.8的乳酸和乙酸為對照，進(jìn)行抑菌試驗分析，以排除有機酸的干擾。

1.5 抑菌物質(zhì)粗提液性質(zhì)的研究

1.5.1 蛋白酶敏感性試驗

將乳酸菌粗提液pH值調(diào)至7.0，依次添加蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，使最終濃度分別為0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.2mg/mL，37℃水浴2h后，調(diào)pH值與粗提液相同，分析抑菌活性。

1.5.2 抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性的試驗

將乳酸菌粗提液分別于37℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴30min，分析其抑菌活性。

1.5.3 pH值耐受性試驗

將乳酸菌粗提液以1mol/L的鹽酸和1mol/L的氫氧化鈉分別調(diào)pH值為3、4、5、6、7、8，分析其抑菌活性。

1.6 菌株生長曲線和產(chǎn)酸特性測定

將乳酸菌菌株按2%（v/v）的接種量接種于15mL MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，每隔2h采用比濁法于波長600nm處測定細(xì)菌細(xì)胞生長量的吸光度值，并測定pH值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度值、pH值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線和產(chǎn)酸特性圖。

1.7 乳酸含量的測定

采用Agilent A1100高效液相色譜（HPLC）儀，色譜柱為Agilent ZORBAX 80A Extend-C18，4.6×150mm，3.5μm.柱溫40℃，流動相為0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH2.3），流速為0.5mL/min，檢測波長為210nm。根據(jù)乳酸標(biāo)準(zhǔn)品、發(fā)酵液、未接種的發(fā)酵液的保留時間定性，外標(biāo)法定量[7]。

1.8 乳酸菌的鑒定

1.8.1 生理生化鑒定

觀察平板上的菌落形態(tài)、革蘭色染色，及選擇乳酸菌微量生化鑒定管反應(yīng)，參照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應(yīng)的指標(biāo)比對鑒定。

1.8.2 16S rRNA 鑒定

細(xì)菌基因組DNA的抽提，參考MARMUR J等[8]的方法提取。以抽提的LAB5、LAB55細(xì)菌DNA組作為PCR擴增的模板，用于16SrRNAPCR擴增的引物為1對通用引物。PCR產(chǎn)物電泳分析及純化后測序。測序得到的序列通過BLAST程序在GenBank基因庫進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的初步篩選

取出從泡菜和臘腸中分離的80株乳酸菌（其中LAB1～LAB45株提取自泡菜，LAB46～LAB80提取自臘腸）。通過牛津杯法初步篩選獲得10株乳酸菌具有對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌表現(xiàn)良好的抑制作用，分別為LAB5、LAB11、LAB12、LAB25、LAB26、LAB32、LAB38、LAB43、LAB45和LAB55。

圖1 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌初篩Figure 1.Preliminarily screening of LAB with high anti-bacterial activity

2.2 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的復(fù)篩

乳酸菌對指示菌的抑菌作用，可能是酸性產(chǎn)物如乙酸、乳酸及其他有機酸的作用。為了排除酸性末端產(chǎn)物的干擾，將培養(yǎng)過夜的10株乳酸菌培養(yǎng)液離心，得到上清發(fā)酵液。上清發(fā)酵液的pH值均在4.5左右，分別以pH值為4.5的乳酸和乙酸為對照，進(jìn)行抑菌試驗分析。同時，利用過氧化氫酶可以降解過氧化氫的特性來排除過氧化氫的干擾，結(jié)果見表1。與發(fā)酵液相同pH值的乳酸和乙酸對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用，而發(fā)酵液有明顯的抑菌活性。經(jīng)過過氧化氫酶處理的發(fā)酵液與原發(fā)酵液相比，LAB12和LAB45上清液的抑菌活性下降明顯，而其他發(fā)酵液抑菌活性降低不顯著。因此，8種乳酸菌所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)不是酸性產(chǎn)物，也不是過氧化氫。

表1 過氧化氫酶處理和有機酸對上清液抑菌效果的影響Table 1.Effect of treatment with catalase and organic acid on the anti-bacterial activity of supernatants mm

2.3 抑菌譜分析

8株菌株對產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的抑菌譜見表2。經(jīng)過抑菌譜分析，發(fā)現(xiàn)8株菌對供試菌株表現(xiàn)一定的抑菌效果，其中LAB5和LAB55對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌具有較強抑菌活性，表明具有較廣譜的抑菌譜，其中LAB55對芽孢桿菌也具有良好的抑菌作用。因此，后續(xù)試驗中選取LAB5和LAB55進(jìn)行抑菌物質(zhì)性質(zhì)和菌株鑒定研究。

表2 乳酸菌對致病菌的抑菌譜Table 2.Anti-bacterial spectrum of LAB mm

2.4 抑菌物質(zhì)粗提液的性質(zhì)

2.4.1 蛋白酶的敏感性

研究通常以抑菌物質(zhì)是否被蛋白酶降解作為區(qū)分細(xì)菌素與類細(xì)菌素的標(biāo)準(zhǔn)，抑菌物質(zhì)粗提液分別經(jīng)蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶處理后，檢測其抑菌活性，結(jié)果（表3）可見，經(jīng)上述3種酶的處理，LAB5和LAB55粗提液抑菌活性均下降，其中對胰蛋白酶的敏感性最高，抑菌活性降低了50%，其次為蛋白酶K，而木瓜蛋白酶處理相對較小。

表3 蛋白酶處理對上清液抑菌活性的影響Table 3.Effect of treatment with proteases on the anti-bacterial activity of supernatants mm

2.4.2 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

LAB5和LAB55上清液經(jīng)不同高溫處理30min后，以未加熱處理為對照，結(jié)果（表4）可見，高溫對抑菌物質(zhì)活性幾乎無影響，2株菌的提取液在100℃處理30min后，仍表現(xiàn)良好的抑菌活性。李南薇等[9]研究燕糖酸奶中分離的乳酸菌100℃處理30min后仍保留強的抑菌活性，敖靈等[10]報道肉源性乳酸菌分泌的產(chǎn)廣譜細(xì)菌素表現(xiàn)較好的熱穩(wěn)定性。

表4 熱處理對上清液抑菌活性的影響Table 4.Effect of heating on the anti-bacterial activity of supernatants mm

2.4.3 抑菌物質(zhì)的耐酸特性

以1mol/L的鹽酸和1mol/L的氫氧化鈉將粗提液分別調(diào)pH值為3、4、5、6、7、8，檢驗其抑菌活性見表5。2株菌上清提取物的抑菌物質(zhì)受pH值影響較大，pH值＜4的酸性條件下pH值越低抑菌效果越強，而pH值＞4的抑菌活性顯著降低，pH值＞5后幾乎失去了抑菌活性，表明2個菌株分泌的細(xì)菌素對酸敏感。

表5 pH值對上清液抑菌活性的影響Table 5.Effect of pH on the anti-bacterial activity of supernamtamnts

2.5 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌生長曲線和產(chǎn)酸特性

LAB5和LAB55菌株的生長曲線和對應(yīng)時間培養(yǎng)液中的pH值變化見圖2。LAB5菌株在6h開始進(jìn)入對數(shù)生長期，在18h進(jìn)入生長穩(wěn)定期。而LAB55在6h進(jìn)入對數(shù)生長期，14h進(jìn)入穩(wěn)定期。2株菌的產(chǎn)酸速率和菌體的生長速度成正相關(guān)趨勢，在進(jìn)入穩(wěn)定期后，溶液中的pH值也趨向于平穩(wěn)。LAB55產(chǎn)酸能力較強于LAB5菌株，最低pH值分別為3.90和4.11。

2.6 菌株乳酸發(fā)酵特性

用高效液相色譜（HPLC）對菌株發(fā)酵液中的乳酸含量進(jìn)行定量測定結(jié)果見圖3。接種LAB5和LAB55發(fā)酵液中乳酸含量明顯增加，通過和乳酸的標(biāo)準(zhǔn)液對照，LAB5、LAB55的乳酸產(chǎn)量分別達(dá)到50g/L和55g/L。

2.7 乳酸菌的鑒定

2.7.1 生理生化結(jié)果

表6 LAB5和LAB55生理生化鑒定結(jié)果Table 6.Physiological and biochemical test results of LAB5 and LAB55

將2株乳酸菌分別進(jìn)行革蘭氏染色和生化鑒定，結(jié)果見表6。將結(jié)果和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中植物乳桿菌的碳水化合物反應(yīng)特征對照，17個指標(biāo)中，LAB5只有纖維二糖、松三糖、棉籽糖、山梨醇、木糖不符，LAB55只有纖維二塘、半乳糖、棉籽糖、山梨醇不符，并且這種不符可能和具體評價標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，因此初步認(rèn)為2個菌株均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.7.2 菌株的16S rRNA結(jié)果

以通用引物進(jìn)行PCR擴增，獲得了2條特異的、大小約為1.5kb的擴增條帶。獲得的特異片段經(jīng)純化和測序后，通過Blast程序與GenBank核酸序列庫中的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)LAB5和LAB55與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的相似性都超過99%。結(jié)合生理生化的鑒定結(jié)果，LAB5和LAB55鑒定為植物乳桿菌。

3 結(jié)論

從傳統(tǒng)泡菜和臘腸中分離的80株乳酸菌中篩選出2株具有較高抑菌活性的乳酸菌LAB5和LAB55，所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以有效抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，可被多種蛋白酶失活，對熱穩(wěn)定、pH值越低抑菌能力越強，該類抑菌物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)活性的細(xì)菌素物質(zhì)。2株乳酸菌具有良好的產(chǎn)酸能力，鑒定為植物乳桿菌。

[1]荊谷，孔健，李德冠，等.乳酸乳球菌L9所產(chǎn)類細(xì)菌素LactococcinGJ-9的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（9）：17-21.

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Screening of biological preservative lactic acid bacteria and characterization of the bacteriocin

ZHU Junli,WANG Ye,LI Jianrong
(College of Food Science and Biotechnology Engineering,Zhejiang Gongshang University,Key Laboratory of Food Safety of Zhejiang Province,Hangzhou 310035,China)

Ten strains lactic acid bacteria(LAB)with high anti-bacterial activity were isolated from 80 LAB strains from traditional fermented pickles and sausage by the method of Oxford cup.After eliminated the disturbances of organic acids,H2O2and analysis of anti-bacterial spectrum,LAB 5 and LAB 55 still exhibited broad-spectrum effects on bacteriostasis.Antimicrobiostatic activity of two fermentation supernatants were both decreased after treated with protease K,trypsin and papain.In addition,LAB 55 is sensitive to papain.Therefore,it was preliminary suggested that the bacteriostats should be protein bacteriocin.The two bacteriocins had good thermal stability,higher anti-bacterial activity with lower pH value.Two strains of LAB5 and LAB 55,with strong ability of acid production,were identified asLactobacillus plantarumby the physiological and biochemical characteristics and 16 SrDNA sequence.

lactic acid bacterium;bacteriocin;anti-bacterial activity

TS201.3

：A文獻(xiàn)標(biāo)志碼:0254-5071（2010）05-0042-04

2010-01-15

國家863項目課題（2007AA091806）

朱軍莉（1979-），女，浙江武義人，博士研究生，研究方向微生物學(xué)。