李 晶 李鯤鵬 柳 正 趙海燕

1(昆明總醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科，昆明 650032)

2(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

3(云南省第一人民醫(yī)院眼科，昆明 650032)

冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)中高分辨率病毒的三維顯示

李 晶1*李鯤鵬2柳 正2趙海燕3

1(昆明總醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科，昆明 650032)

2(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

3(云南省第一人民醫(yī)院眼科，昆明 650032)

利用冷凍電鏡顯微技術(shù)和單顆粒三維重建方法獲得分辨率為1.3 nm的BmCPV(家蠶質(zhì)多角體)，1.3 nm的BmCPV+mab(家蠶質(zhì)多角體與抗體復(fù)合物)，2.5 nm的CSBV中蜂囊裝幼蟲病病毒，1.4 nm的 C6/36濃核病毒(C6/36DNV)組成的三維結(jié)構(gòu)體數(shù)據(jù)。對三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)歸并，并找到對顯示細(xì)節(jié)較為敏感的向量維度，用三維可視化技術(shù)對病毒做出快速高效顯示。與原有顯示方法相比，時間和信噪比有了顯著提高，病毒表面細(xì)節(jié)和軸上突起更加清晰可見。為高分辨病毒三維重構(gòu)開辟了新的可視方法。

冷凍電子顯微技術(shù);三維重構(gòu);三維顯示;病毒

引言

病毒給予人類極大的危害，防治病毒是人類的重要任務(wù)。根據(jù)病毒結(jié)構(gòu)上20面體對稱的特性，計算機(jī)三維重構(gòu)與冷凍電鏡技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生冷凍電鏡單顆粒技術(shù)(CryoEM)，成為研究病毒結(jié)構(gòu)功能的主要手段［1］。應(yīng)用此技術(shù)對病毒研究，最早是Crowther提出的［2］。該技術(shù)利用20面體的對稱性和中央截面定理，確定電子顯微圖像中病毒顆粒的空間取向和中心位置，然后把大量的、確定了取向和中心位置的病毒顆?？臻g疊加，重構(gòu)出病毒的三維結(jié)構(gòu)。至今，已經(jīng)用此技術(shù)得到了大量病毒的三維結(jié)構(gòu)［3］。用 Fourier-Bessel 合成法［4］進(jìn)行三維重構(gòu)，所得到的體數(shù)據(jù)中包含了噪聲、空間疊加的位置誤差，以及傅里葉變換等重構(gòu)過程中的不良影響，導(dǎo)致在病毒的三維顯示中出現(xiàn)偽結(jié)構(gòu)［5］。為了消除這些影響，近年來出現(xiàn)了大量的病毒三維顯示的研究［6］。比較成熟已經(jīng)開始在國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室中大量使用的軟件有IRIS explorer，但它存在顯示速度慢、顯示參數(shù)較多、參數(shù)設(shè)定復(fù)雜、域值對噪聲的敏感度較低等缺陷。為此，本研究應(yīng)用可視化技術(shù)，首先對體數(shù)據(jù)進(jìn)行歸并，繼而分析了顯示平滑度和顯示細(xì)節(jié)之間的關(guān)系，建立了新的顯示域值體系。對高分辨率的重建數(shù)據(jù) BmCPV(家蠶質(zhì)多角體)、BmCPV+mab(家蠶質(zhì)多角體與抗體復(fù)合物)、CSBV中蜂囊裝幼蟲病病毒、C6/36DNV(C6/36濃核病毒)進(jìn)行了三維顯示，得到了滿意的結(jié)果，并驗(yàn)證了方法的快速高效。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)室多年來進(jìn)行冷凍電鏡病毒單顆粒技術(shù)的三維重構(gòu)研究，現(xiàn)已經(jīng)得到多種較高分辨率的病毒三維重構(gòu)體數(shù)據(jù)。其中，包括有分辨率為1.3 nm的 BmCPV(家蠶質(zhì)多角體病毒)與1.3 nm的BmCPV+mab(家蠶質(zhì)多角體與抗體復(fù)合物［7］;2.5 nm的CSBV中蜂囊裝幼蟲病病毒［8］;1.4 nm的C6/36濃核病毒(C6/36DNV)的三維結(jié)構(gòu)體數(shù)據(jù)［9］。以上述4種病毒高分辨三維重構(gòu)的體數(shù)據(jù)作為依據(jù)進(jìn)行三維顯示研究。

1.2 方法

體數(shù)據(jù)的三維顯示是將三維數(shù)據(jù)投影到二維圖像顯示器平面上，并利用計算機(jī)圖形學(xué)的原理和技術(shù)，通過使用光照、透視及旋轉(zhuǎn)等方法，獲得三維視覺效果。目前的三維顯示技術(shù)基本上可以分為面繪制和體繪制兩大類。表面繪制的一般步驟是:首先在二維序列圖像上提取對象的輪廓線，然后利用三角形面片來近似相鄰的輪廓線之間的等值面，從而得到要顯示對象的完整表面，最后采用傳統(tǒng)的圖形學(xué)方法加以顯示。當(dāng)體數(shù)據(jù)的采樣密度足夠大時，可以采用MC(marching cube)方法在表面體素內(nèi)部提取等值面，得到高質(zhì)量的表面顯示結(jié)果。表面繪制的優(yōu)點(diǎn)是可以清晰顯示對象的表面情況，配合通用的顯卡加速，具有較好的實(shí)時交互性。體繪制技術(shù)出現(xiàn)的時間較晚，是近幾年三維顯示技術(shù)研究的一個熱點(diǎn)。它可以完整地反映數(shù)據(jù)域中所包含的整體信息，不需要構(gòu)造中間幾何圖形元素，直接使三維空間數(shù)據(jù)場的采樣可視化，單獨(dú)或同時顯示濃淡變化的表面和灰度實(shí)體。

體數(shù)據(jù)的空間位置由體數(shù)據(jù)的空間坐標(biāo)決定，明暗屬性由每個像素點(diǎn)的方向矢量決定。方向矢量的計算是:給出了x方向上的分量，y、z方向的分量有同樣的形式，即

其中，N的大小決定了顯示表面的平滑度。隨著N增大，平滑程度逐漸提高，而細(xì)節(jié)卻逐漸消失。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)N=3時，兼顧了平滑效果和顯示細(xì)節(jié)，使顯示達(dá)到最佳效果。設(shè)體數(shù)據(jù)空間像素為M(x，y，z)，其均值 avg，則方差為

做如下數(shù)據(jù)歸并:當(dāng) M(x，y，z)≥avg+4msq時，取 M(x，y，z)=255;當(dāng) M(x，y，z)≤avg+4msq時，取 M(x，y，z)=0，其他為 M(x，y，z) ∈ (0，255)。

2 結(jié)果

基于以上方法研制開發(fā)了針對單顆粒技術(shù)病毒重構(gòu)體數(shù)據(jù)的三維顯示方法，并在 PC機(jī)上的Visual C++8.0開發(fā)環(huán)境下，附帶有 OPGL接口，自主開發(fā)了應(yīng)用軟件Cryo-Electron Microscopy 3-Dimension Display System (CEM3DDS)。將CEM3DDS與IRIS explorer在顯示速度和信噪比方面進(jìn)行了比較得出以下結(jié)果。圖1為IRIS和CEM3DDS兩種軟件對相同體數(shù)據(jù)bmCPV在不同閾值下顯示耗時的比較。兩個軟件有在相同硬件條件的PC機(jī)上(CPU為AMD 3000，F(xiàn)ireGL T2-128)運(yùn)行，由圖1可見，相同的體數(shù)據(jù)在各個閾值下，對較小的閾值，顯示速度接近，在 A點(diǎn)(閾值100)以后，CEM3DDS的顯示速度明顯快于 IRIS。圖2為IRIS和CEM3DDS在不同閾值下信號與噪聲的幅度比較。實(shí)驗(yàn)分別測試了兩個軟件在不同閾值下所顯示圖像的信號以及噪聲的幅度。由圖2可見:在閾值的整個取值范圍內(nèi)，CEM3DDS的信噪比大于IRIS的信噪比;說明閾值在 CEM3DDS對噪聲更加敏感，有利于顯示質(zhì)量的提高。圖3是CEM3DDS對BmCPV與C6/36DNV的三維顯示;(a)和(b)為不同方位的BmCPV三維顯示圖像，病毒的細(xì)節(jié)清晰可見;(c)和 (d)為 C6/36DNV的三維顯示，是從5次軸兩個不同方向觀察的結(jié)果。5次軸的定點(diǎn)突出，清晰可見。圖4為半個 BmCPV+mab矢狀面、冠狀面和橫斷面3個中垂直面的顯示，CEM3DDS不但能夠?qū)Σ《具M(jìn)行三維外部結(jié)構(gòu)的顯示，還能對病毒內(nèi)部的任意剖面進(jìn)行顯示，可見BmCPV+mab病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰完整。圖 5是半個 CSBV、BmCPV+mab的三維顯示，從不同方位的CSBV三維顯示圖像可見，外部細(xì)節(jié)分明，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰。同樣，BmCPV+mab的三維顯示可見，BmCPV與 mab結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)清晰。由圖3與圖5的比較，可見BmCPV與 BmCPV+mab在結(jié)構(gòu)上的不同，在BmCPV+mab突起的頂點(diǎn)多出了一個結(jié)構(gòu)，稱為ASpike，這個部分的結(jié)構(gòu)與病毒功能有著密切的關(guān)系［10］。

圖1 IRIS和CEM3DDS在不同閾值下顯示速度的比較Fig.1 Comparison of display speed between IRIS and CEM3DDS under different threshold

圖2 IRIS和CEM3DDS在不同閾值下信號與噪聲的幅度比較Fig.2 Amplitudes of signal and noise of IRIS and CEM3DDS under different threshold

圖3 BmCPV與C6/36DNV的三維顯示。(a)BmCPV 30°方位角;(b)BmCPV 60°方位角;(c)C6/36DNV 30°方位角;(d)C6/36DNV 60°方位角Fig.3 3D display results of BmCPV and C6/36DNV.(a)BmCPV azimuthalangle30°;(b)BmCPV azimuthal angle 60°;(c)C6/36DNV，azimuthal angle 30°;(d)C6/36DNV，azimuthal angle 60°

圖4 BmCPV+mab一半體數(shù)據(jù)中垂直面的顯示。(a)矢狀面;(b)冠狀面;(c)橫斷面Fig.4 3D display of a hemispherical volume data.(a)vertical section;(b)coronal;(c)transect

圖5 CSBV，BmCPV+mab的三維顯示，(a)CSBV，90°方位角;(b)CSBV，－90°方位角;(c)CSBV，0°方位角;(d)CSBV，30°方位角;(e)BmCPV+mab，90°方位角;(f)BmCPV+mab，－90°方位角;(g)BmCPV+mab，0°方位角;(h)BmCPV+mab，30°方位角Fig.5 3D display results of CSBV and BmCPV+mab.(a)CSBV，azimuthal angle 90°;(b)CSBV，azimuthal angle －90°;(c)CSBV，azimuthal angle 0°;(d)CSBV，azimuthal angle 30°;(e)BmCPV+mab，azimuthal angle 90°;(f)BmCPV+mab，azimuthal angle － 90°;(g)BmCPV+mab，azimuthal angle 0°;(h)BmCPV+mab，azimuthal angle 30°

3 討論

冷凍電鏡計算機(jī)的三維重構(gòu)技術(shù)包括:樣品制備、冷凍電鏡成像和數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、三維結(jié)構(gòu)顯示和解釋。重構(gòu)過程非常復(fù)雜，往往同樣的樣品、同樣的重構(gòu)條件，得出不同的重建顯示結(jié)果。導(dǎo)致重構(gòu)結(jié)果誤差的主要因素包括:樣品的電子輻射損傷、電子源的空間相干性、病毒圖像的低襯度導(dǎo)致確定病毒顆粒的取向和中心的誤差，其結(jié)果均是在所重構(gòu)的體數(shù)據(jù)中包含了病毒的偽結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。筆者通過體數(shù)據(jù)場的數(shù)據(jù)歸并，控制方向矢量求解中的矢量維度，獲得了新的病毒顯示方法。新方法用于可用單顆粒技術(shù)重構(gòu)的病毒，這種技術(shù)要求病毒樣品是全同性的。

就顯示方法而言，CEM3DDS是由灰度體數(shù)據(jù)直接顯示的，避免了面顯示等值面提取帶來的誤差。同時，通過不同透明度和顏色的設(shè)定，可以顯示對象內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和特征，其缺點(diǎn)是較表面顯示要計算量大。但是，對于生物樣品，直接顯示技術(shù)能提供更重要的結(jié)構(gòu)信息。通過對體數(shù)據(jù)進(jìn)行的數(shù)據(jù)歸并，首先對體數(shù)據(jù)的范圍進(jìn)行了壓縮，有利于顯示速度的提高;其次使每個圖像數(shù)據(jù)均具有三維體數(shù)據(jù)的整體信息，使得閾值對噪聲的敏感性增強(qiáng)，有利于高效地顯示圖像信息。與 IRIS explorer方法進(jìn)行了比較，CEM3DDS在顯示速度、閾值噪聲響應(yīng)等方面，均有較大提高。在使用時，IRIS explorer需要設(shè)置多個顯示參數(shù)，一旦參數(shù)選擇不符合要求，病毒的重要結(jié)構(gòu)將不能顯示，尤其對初學(xué)者。而在CEM3DDS設(shè)計時，已將部分參數(shù)設(shè)置于程序之中，不需要使用軟件在界面上設(shè)置。例如，IRIS explorer將三維光照效果的參數(shù)均放于用戶界面上，供使用者調(diào)整，但軟件的初學(xué)者很難進(jìn)行正確的選擇。而CEM3DDS已經(jīng)在程序中將光照效果設(shè)置好，無需在程序界面中調(diào)整光照。另外，新方法CEM3DDS將閾值壓縮在0～255之間，而 IRIS explorer的閾值無限定。這說明，在閾值的選擇和設(shè)置時，CEM3DDS的操作比IRIS explorer要簡潔。

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3D Display of High-resolution Virus in Electron Cryomicroscopy Single Particle Reconstruction

LI Jing1*LI Kun-Peng2LIU Zheng2ZHAO Hai-Yan3
1(Department of Medical Engineering of Kunming General Hospital，Kunming 650032，China)
2(State Key Laboratory for Biocontrol，School of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China)
3(Department of Ophthalmology，The First People Hospital of Yunnan Provin，Kunming 650032，China)

electron eryo-microscopy;3D display;virus

R318.07

D

0258-8021(2010)04-0632-04

10.3969/j.issn.0258-8021.2010.04.025

2009-09-23，

2010-05-14

國家自然科學(xué)基金資助項目(30770540);成都軍區(qū)醫(yī)學(xué)科研計劃課題(MB07026)

*通訊作者。E-mail:li_jingkm@126.com